_D_半乳糖苷酶活性测定方法的研究_周晓辉

河󰀁北󰀁工󰀁业󰀁科󰀁技

第21卷󰀁第5期󰀁第16页HEBEIJOURNALOFINDUSTRIALVol.21󰀁No.5󰀁P.16总第87期󰀁󰀁󰀁󰀁2004年SCIENCE&TECHNOLOGYSum87󰀁󰀁󰀁2004

󰀁󰀁文章编号:1008-1534(2004)05-0016-03

󰀁-D-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

周晓辉

(河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄󰀁050018)

摘󰀁要:应用分光光度计建立一种简便检测󰀁-D-半乳糖苷酶(GAL)活性的方法。酶反应条件研究

表明,在总体积为1mL的0.1mol/L柠檬酸反应缓冲体系(pH值为4.5)中含0.8󰀁mol的底物邻硝

基苯󰀁-D-吡喃半乳糖(ONPG),含相当于2mg左右蛋白质的酶提取液,37󰀁孵育30min后用

0.5mol/L碳酸钠1mL终止反应,用紫外分光光度计于405nm波长测定的吸光度值最能反映该酶

活性。结果显示,该方法的批内变异系数在3.92%~4.89%之间,批间变异系数为3.8%,均小于

5%;在所检测该酶质量浓度范围(1~2.5mg/mL)内线性关系良好,当反应体系的蛋白含量低于0.

5mg/mL时,酶活性不能被检出;每组的平均回收率均在95%~105%之间,说明在所检测浓度范围

内回收良好。因此,该方法具有稳定性好、灵敏度高、简便易行等特点,适合一般实验室应用。

关键词:󰀁-D-半乳糖苷酶;活性测定;粘膜

中图分类号:Q556;R735󰀁󰀁󰀁文献标识码:A

󰀁󰀁󰀁-D-半乳糖苷酶全称为󰀁-D-半乳糖苷半乳糖水

解酶(EC3.2.1.23󰀁-D-GalactosidaseGAL)属于水解

酶类,能分解食物中的乳糖及其他半乳糖苷。该酶

主要分布在植物、微生物及哺乳动物肠内,其与食品

工业、医药卫生较为密切,因而研究较多。GAL除参

与乳糖的消化吸收外,也是水解蛋白多糖的重要水

解酶。该水解酶不仅可水解氨基多糖侧链上的半乳

糖与N-乙酰氨基葡萄糖之间半乳糖苷键,而且能水

解氨基多糖与核心蛋白连接区的糖苷键[1],使氨基

多糖侧链与核心蛋白解离,从而导致大分子蛋白多

糖解体,破坏基底膜和细胞外间质屏障,进而促进癌

细胞的浸润和扩散。因此建立一种测定GAL活性

的实验方法对研究GAL活性变化与消化道肿瘤形

成及发展之间的关系有一定的实际意义。

1󰀁材料和方法

1.1󰀁材󰀁料

1)实验动物:实验用Sprague-Dawley(SD)大

收稿日期:2004-05-18责任编辑:陈玉堂作者简介:周晓辉(1975-),女,黑龙江齐齐哈尔人,讲师,硕士,主要从事生物工程领域的研究工作。鼠,雄性,体重200~250g,河北省实验动物中心提

供。

2)试剂:邻硝基苯󰀁-D-吡喃半乳糖(o-Nitro-

phenyl󰀁-D-galactopyranoside,ONPG)为Sigma公司产

品,󰀁-巯基乙醇购自华美生物工程公司,邻硝基苯酚

(ONP)及其他试剂为国产分析纯产品。

1.2󰀁方󰀁法

󰀁󰀁1)肠粘膜GAL提取液的制备󰀁用质量分数为

25%的乌来糖麻醉SD大鼠(0.5mL/100g体重),打

开腹腔,迅速取出结肠,浸于冷生理盐水中,洗净肠

腔内容物,纵向剖开肠腔,刮取肠粘膜按5mL/g组

织加入提取液(10mmol/L磷酸缓冲液,pH值为6.

5)制备匀浆,4󰀁,12000r/min离心20min,取上清

液-20󰀁保存备用。

2)蛋白测定󰀁上述提取液用改良酚试剂法测定

蛋白含量,以牛血清白蛋白为标准物。

3)酶活性的测定󰀁参照Gi-lMart󰀁nE等人的方

法[2]略加改进。在总体积为1mL的柠檬酸反应缓

冲液(0.1mol/L柠檬酸用NaOH调至pH值为4.5)

体系中含0.8󰀁mol的底物ONPG和40󰀁mol󰀁-巯基

乙醇(临用前配制),酶提取液适量(相当于2mg左

右蛋白质)。在37󰀁孵育30min后,用0.5mol/L冷碳酸钠1mL终止反应,用紫外分光光度计于405nm波长测定吸光度值,同时设定底物对照和酶提取液

对照。产物邻硝基苯酚(ONP)显黄色,在405nm处

有最大吸收峰。

酶活性计算公式:

U(GAL)=A0.777󰀁30󰀁m。

式中:A为反应生成的ONP吸光度值,A=A(反应

液)-A(底物)-A(酶提取液);0.777为1󰀁mol邻

硝基苯酚(ONP)的吸光度值;m为反应体系中的酶

蛋白量,单位是mg。酶活力单位U定义为标准条

件下(pH值为4.5,37󰀁)每分钟催化生成1󰀁mol产

物邻硝基苯酚(ONP)所需的酶量为1个单位。

4)反应产物吸收光谱的测定󰀁取2mmol/L的

ONP2mL(含4󰀁molONP)测定不同波长下的吸光度

值;同时按酶活性的测定方法在相应波长测定酶促

反应产物的吸光度值,以波长为横坐标,吸光度为纵

坐标绘制曲线。

2󰀁结果与讨论

2.1󰀁测定GAL活性的最佳反应时间

取GAL提取液加底物ONPG后,按上述酶活性测

定方法分别于37󰀁反应2,5,10,15,20,25,30,40,50

min后终止反应,在405nm处测定A值,见图1。在

反应的初始25min内,吸光度以线性关系递增,而反

应进行至25~40min时,吸光度不发生明显变化。而

后,随着时间的增加,吸光度呈上升趋势。这说明,反

应时间在25~40min内酶活性相对稳定,提示应在此期间内进行吸光度值的测定。

图1󰀁不同时间酶促反应A值

Fig.1󰀁Aofreactionproductindifferenttime

2.2󰀁反应产物的特异性

为了检查酶促反应体系中所生成的产物是否为

ONP,测定了酶促反应产物在不同波长下的吸光度

值,结果表明,反应产物在395~410nm处有最大吸收峰。与标准品的吸收光谱较一致(见图2),说明

在405nm波长下所测得的吸光度值可表示反应体

系中ONP的生成量。

图2󰀁邻硝基苯酚和酶促反应产物的吸收光谱

Fig.2󰀁AbsorptionspectrumofONPand

thereactionproduct

2.3󰀁批内、批间精密度

取酶提取液,按上述酶活性测定方法将同一标

本重复测定6次,每次10管,计算批内变异系数;将

同一提取液分装后每隔1~2d测定GAL活性1次,

每次测10管,共测5次。计算各次平均值的批间变

异系数。6次GAL活性测定的变异系数在

3.92%~4.89%之间(4.89%,3.92%,4.53%,

4.53%,4.54%和4.79%),小于5%;5批测定结果

的平均值之间的变异系数为3.8%,亦小于5%,这

说明此方法具有较高的精密度。

2.4󰀁线性关系及灵敏度

取酶提取液按最终反应体系蛋白质量浓度分别

为3,2.5,2,1.5,1,0.5和0.3mg/mL进行稀释,用

上述酶活性测定方法精确测定GAL活性。每个浓

度均设底物与酶提取液对照,将测定结果对蛋白浓

度进行作图,确定线性关系的最佳浓度范围及最低

可检测限。

由图3可见,当反应体系中酶提取液的蛋白质

图3󰀁不同蛋白质量浓度对GAL活性的影响

Fig.3󰀁EffectofproteinconcentrationonGALactivity17󰀁第5期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁周晓辉󰀁󰀁-D-半乳糖苷酶活性测定方法的研究量浓度为1.0~3.0mg/mL时线性关系最佳(r=

0.99),说明在此范围内相关性良好。当反应体系中

酶提取液的蛋白质量浓度低于0.5mg/mL时,酶活

性不能被检出。

2.5󰀁回收率实验

1)标准曲线的建立󰀁用反应缓冲液配制20

mmol/LONP贮存液,从中取出80󰀁L,加入920󰀁L反

应缓冲液,作连续倍比稀释使ONP含量分别为0.8,

0.4,0.2,0.1,0.05,0.025,0.0125󰀁mol。在405nm

处测定吸光度值,以吸光度为纵坐标,物质的量为横

坐标绘制标准曲线。

2)回收率的测定󰀁分别测定5份酶提取液的

吸光度值后,向反应体系中加入5,10,20,30,40󰀁L

的0.02mol/LONP溶液,物质的量分别增加0.1,0.

2,0.4,0.6,0.8󰀁mol,每个浓度点4管,显色后再次

测定吸光度值,与理论值比较,计算5组的平均回收

率分别为101.1%,100%,96.7%,100%,95.8%,均

在95%~105%之间,说明在所检测浓度范围内回收

良好。

3󰀁结󰀁论

小肠粘膜中存在的GAL能分解乳糖及其他半

乳糖苷,在糖的消化吸收中具有重要作用。GAL除

参与乳糖的消化吸收外,也是水解蛋白多糖的重要

水解酶。不仅可水解氨基多糖侧链上的半乳糖与

N-乙酰氨基葡萄糖之间半乳糖苷键,而且能水解氨

基多糖与核心蛋白连接区的糖苷键[1]。使氨基多糖

侧链与核心蛋白解离,从而导致大分子蛋白多糖解

体,破坏基底膜和细胞外间质屏障,同时肿瘤细胞还

可以分泌各种水解酶破坏癌周间质[3]从而促进癌细胞的浸润和扩散。此外,GAL活性上升可导致细胞

膜表面糖蛋白和糖脂的糖链降解[4],使机体对肿瘤

细胞的免疫识别能力降低,因而促进了肿瘤的发展

与转移。因此建立一种测定GAL活性的实验方法

对研究GAL活性变化与消化道肿瘤形成及发展之

间的关系有一定的实际意义。

目前,对GAL的活性测定国内外多采用分光光

度法和荧光法,后者操作较繁琐,所用设备昂贵。本

文所建立的分光光度法是依据GAL可催化ONPG

水解生成ONP,后者在405nm处有最大吸收峰,用

酶促反应后405nm吸光度的增加值(减去对照的吸

光度值)检测GAL活性的高低。此方法具有稳定性

好、重复性好、精密度高及简便易行等优点,适合一

般实验室应用。本实验应注意以下几点:1)酶提取

液用量以每毫升含有2mg左右蛋白为宜;2)因GAL

为酸性水解酶,其最适pH=4.5,在pH值为4.5的

0.1mol/L柠檬酸缓冲液中具有最大活性,Na+是

GAL激动剂。

参考文献:

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StudyonAssayMethodof󰀁-D-GalactosidaseActivity