多重PCR技术对沙门菌毒力因子检测

２４　中国兽医杂志２０１２年（第４８卷）第７期　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　

多重ＰＣＲ技术对沙门菌毒力因子检测　

邱　立，郝华芳，王兴龙，张淑霞，张耀相，张渭东，杨增岐　

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌７１２１００）　

摘要：为了检验多重ＰＣＲ技术在沙门菌毒力鉴定中的临床应用效果，评价沙门菌在陕西关中地区的流行情况，从该地区　多家养殖场分离获得１９株细菌，分别利用生化试验与小鼠攻毒试验和多重ＰＣＲ技术鉴定和检验了沙门菌及其毒力。结果表　明，多重ＰＣＲ技术对分离沙门菌的鉴定结果和生化试验鉴定结果一致，符合率达１００　；毒力质粒携带情况与小鼠攻毒结果　

一致；同时鉴定出陕西省多家养殖场中存在携带毒力基因菌株，值得关注其对畜禽养殖的潜在威胁。多重ＰＣＲ技术能够快　速、简便、灵敏度高和特异性强的鉴定沙门菌，并可鉴定出其毒力，可以用于致病性沙门菌的流行病学检测，值得在兽医临床　和畜产品沙门菌污染的检测中推广应用。　关键词：沙门菌；毒力；多重ＰＣＲ　

中图分类号：￥８５２．６１　２　文献标识码：Ａ　文章编号：０５２９—６００５（２０１２）０７—００２４—０３　

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　

ＱＩＵ　Ｌｉ，ＨＡＯ　Ｈｕａ—ｆａｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｘｉｎｇ—ｌｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｓｈｕ—ｘｉａ，　

ＺＨＡＮＧ　Ｙａｏ—ｘｉａｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｉ—ｄｏｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｚｅｎｇ—ｑｉ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｕｓｅ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｐｉｄｅ－　

ｍｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｉｎ　Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｅｅ，１　９　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｆａｒｍｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　

ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｍｉｃｅ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　ｍｏｄｅｌ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　

ＰＣＲ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｏ　ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　

ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ａｎｄ　ｍｉｃｅ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｃａｎ　ｒａｐｉｄｌｙ　ａｎｄ　

ｅａｓｉｌｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ　ｍａｙ　ｐｒｏｖｉｄｅ　

ｗｉｄｅｌｙ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｎｉｍａｌ　

ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ；ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＹＡＮＧ　Ｚｅｎｇ—ｑｉ　

沙门菌是肠杆菌科中一大类重要的人畜共患病　

病原菌，广泛分布于自然界，是畜禽肉胴体、畜禽产　

品污染的重要来源，感染畜禽后可引起一系列的疾　

病，并可通过消化道等途经传染给人，引起人的食源　

性疾病。　

目前已发现，鼠伤寒、猪霍乱、都柏林沙门菌病、　

肠炎、羊流产、马流产、鸡伤寒、鸡白痢、伤寒、丙型副　

伤寒等沙门菌具有毒性质粒，可增强对寄主肠黏膜　

上皮细胞的粘附与侵袭作用，提高在网状内皮系统　

中存活和增殖的能力，其对小鼠的毒性比无毒性质　

粒菌株强数百至数万倍不等［１　］。然而到目前为止，　

用于鉴定沙门菌毒力的方法十分有限。小鼠致病性　

收稿日期：２０１卜１Ｏ一２７　基金项目：陕西省科学技术研究发展计划项目（２０１０Ｋ０１—２８）　作者简介：邱立（１９７７一），女，讲师，博士生，主要从事动物疫病防　制研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑ１５２５＠１２６．ｃｏｒｎ　通讯作者：杨增岐，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｚｑｌ１０６＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ　试验是常用来评价细菌毒力的方法，但是受到小鼠　

品系、日龄、体重等多种因素影响，鉴定结果稳定性　

差，而且费时费力。特别是在兽医临床实践中，快速　

确定病因能够有效减少经济损失，而沙门菌是临床　

病料中最常分离到的细菌之一，快速确定沙门菌有　

无毒力，对准确确定病因具有重要意义。多重ＰＣＲ　

方法，能够快速简便的鉴定有毒力的沙门菌，对标准　菌株的检测结果准确＿３］，如果该方法同样能够准确　

鉴定临床分离沙门菌毒力，将在给兽医临床诊断带　

来极大方便。　

为检验多重ＰＣＲ检测方法的临床应用效果和　

研究陕西关中地区致病性沙门菌的流行情况，进行　

了以下试验。　

１材料与方法　１．１病料　在陕西杨凌、武功、宝鸡等发病的畜禽　

场，无菌采取病死动物的肝脏、脾脏或发病部位；２～３　

周发病动物，

用棉拭子采集新鲜粪便或采集尿液，无　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａ１　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　中国兽医杂志２０１２年（第４８卷）第７期　２５　

菌导尿或采集中段尿。Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ病料为猪病料，Ｂ　

病料为鸡病料，Ｃ病料为羊病料，Ｆ病料为奶牛病料。　

１．２培养基普通培养基、麦康凯培养基、伊红一美　

蓝培养基、Ｓ．Ｓ．琼脂平板、苏木素伊红琼脂培养基、　

亚硫酸铋琼脂培养基（ＢＳ）、普通肉汤等。硝酸钾蛋　

白胨水，邓亨氏蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，明胶培　

养基，柠檬酸盐利用培养基，三糖铁培养基，Ｏ／Ｆ培　

养基及各种糖培养基等，均按常规方法［６。　制备。　

１．３试剂革兰染色液、欧立希氏试剂、硝酸钾还　

原试验用甲液和乙液、Ｍ．Ｒ．试验的甲基红溶液、　

３　Ｈ　ｏ。、１Ｏ　ＦｅＣＩ。、Ｖ－ｐ试验用甲液和乙液等，均　

由西北农林科技大学动物科技学院兽医微生物实验　

室提供。ＤＬ一２　０００、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ酶等试剂，购自宝　

生物工程（大连）有限公司。　

１．４　ＰＣＲ引物　针对沙门菌组氨酸转运操纵子　

ｈｉｓ　Ｊ、毒力质粒ｓｐｙ　Ｒ基因、ｆｌｉ　Ｃ基因的特异性引　

物由兽医微生物学实验室保存，序列见文献［３］。　

１．５细菌的分离培养将不同病料增菌，普通肉汤　

增菌，肉汤培养物变混浊，对增菌后的肉汤进行稀　

释，针对不同形态的菌落，涂片、染色、镜检，采取划　

线法进行挑纯培养，直到获得纯培养物，置４℃的冰　

箱保存备用。　

１．６细菌的生化鉴定　用分离菌纯培养物有目的　

进行糖发酵试验，按文献Ｅ５３方法进行。　１．７　细菌的致病性试验　３７℃培养分离鉴定的６　

株沙门菌，ＯＤ　。。达到１．０时用于攻毒试验，接种方　

法按文献Ｅｓ－ｉ方法进行。分别腹腔注射５只昆明系　

小鼠（购自解放军第四军医大学），每只小鼠注射　

１Ｏ。个菌落形成单位的细菌（ＣＦＵ／ｍＬ），每隔６　ｈ记　

录小鼠死亡情况。　

１．８　ＤＮＡ提取和ＰＣＲ检测　参考刘华伟［６　等方　

法，进行沙门菌的ＤＮＡ提取和多重ＰＣＲ检测，　

ＰＣＲ产物经ｌ＿５　琼脂糖凝胶电泳分析。　

２　结果　

２．１　细菌分离结果　共分离菌株１９株，分别用　

Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｄ１、Ｄ３、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１、　Ｆ２、Ｆ３、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４表示。　

２．２　生化试验鉴定结果根据文献［－７３进行生化试　

验鉴定，据生化试验结果可知１９株细菌中Ａ１为猪　

霍乱沙门菌、Ａ２为大肠杆菌、Ａ３为猪葡萄球菌；Ｂ１　

为金黄色葡萄球菌、Ｂ２为鸡沙门菌；Ｃ１为大肠杆　

菌、Ｃ２为费氏柠檬酸杆菌、Ｃ３为沙门菌Ｉ系；Ｄ１为　

溶血葡萄球菌、Ｄ２为不活跃大肠埃希氏菌；Ｅ１为沙　

门菌Ｉ系、Ｅ２为革兰阳性球菌，未确定菌株；Ｆ１为　

大肠杆菌、Ｆ２为金黄色葡萄球菌、Ｆ３为鼠伤寒沙门　

菌；ＧＩ为革兰阳性球菌，未确定菌株，Ｇ２为猪葡萄　

球菌、Ｇ３为肠链球菌、Ｇ４为猪伤寒沙门菌，生化试　

验结果见表１。　

表１病料分离菌株生化试验结果　

＋：阳性；一：阴性；×：未做　‘　

２．３　ＰＣＲ鉴定结果　利用ＳＪＦ１／ＳＪＲ１，ＳＰＦ２／　测，ＰＣＲ结果如图１所示，Ａ１、Ｂ２、Ｃ３、Ｅ１、Ｆ３、Ｇ４扩　

ＳＰＲ２，ＳＨＦ１／ＳＨＲｉ对分离菌株进行三重ＰＣＲ检　增出３５９　ｂｐ大小的ｈｉｓ　Ｊ条带，为沙门菌菌株，Ａ１、

　２６　中国兽医杂志２０１２年（第４８卷）第７期　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　

Ｂ２、Ｆ３扩增出大小为７８９　ｂｐ大小的ｓｐｙ　Ｒ的条带，　

为含毒力基因的菌株，而Ｆ３菌株还扩增出大小为　

５２３　ｂｐ的ｆｌｉｃ—ｉ基因，表明Ｆ３菌株含有Ｈ１一ｉ抗原。　

２．４动物致病性试验结果　每组用５只小鼠进行　

攻毒试验，记录攻毒小鼠死亡时间，并取死亡鼠脾脏　

进行细菌分离，结果见图２和表２。小鼠最早死亡　

２　ｌ　时间是攻毒后１２　ｈ，Ａ１组５只小鼠最早全部死亡，　

最后１只小鼠死亡时间为攻毒后２４　ｈ，Ｂ２组和Ｆ３　

组最后一只小鼠死亡时间分别为攻毒后３６　ｈ和攻　

毒后３０　ｈ。Ｇ４组１只小鼠死亡，ｃ３组和Ｅ１组小鼠　

未见死亡。对照组全部存活。　

图１三重ＰＣＲ检测部分分离菌株　

表２沙门菌分离株感染小鼠的死亡率、分离率及剖检变化　ｂｐ　２　０００　１　０００　７５０　５００　２５０　

１Ｏ０　

６　ｌ２　１８　２４　３０　３６　４２　４８　（ｈ１　

图２攻毒后小鼠存活只数　＋Ａｌ　＋Ｂ２　—由一Ｃ３　－＿Ｅ１　—＊一Ｆ３　—　Ｇ４　一对照　

３讨论　

ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）是一种特异　基因的体外快速扩增技术，相比传统的微生物检测　

方法具有无需培养、快速简便、特异性高、灵敏性强　

等优点，已广泛用于病原微生物的快速检测，尤其适　

用于不易分离培养及含量极少的病原微生物标本的　

快速检测。多重ＰＣＲ技术可同时检测一种致病菌　

的多个基因，也可以同时检测多种致病菌，相比普通　

ＰＣＲ技术具有特异性增强、节约试剂、工作量低等　

优点，已广泛应用于包括沙门菌在内的多种病原微　

生物的检测与鉴定Ｌ８　。　

传统的沙门菌毒力检测方法需要先进行细菌的　

分离培养，再结合生化分析和小鼠攻毒试验综合判　

断，检测过程复杂、周期长、所需试剂繁多。利用多　

重ＰＣＲ技术可用于沙门菌毒力的快速检测。　刘华伟等利用多重ＰＣＲ技术特异性扩增沙门　

菌组氨酸转运操纵子ｈｉｓ　Ｊ基因、毒力质粒ｓｐｙ　Ｒ基　

因和Ｈ１抗原‘ｆｌｉ　Ｃ基因。５株沙门菌强致病性标　

准菌株均能特异性扩增出沙门菌毒力质粒基因ｓｐｙ　

ＲＬ　。但是该方法的推广应用，需要临床样品的检　

验。因此，采集陕西省关中地区多家发病养殖场病