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氟硼二吡咯类共轭聚合物均相检测miRNA研究

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2019年河北大学学报(自然科学版)2019

第39卷 第3期JournalofHebeiUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.39No.3

DOI:10.3969/j.issn.10001565.2019.03.005

氟硼二吡咯类共轭聚合物均相检测miRNA研究

张江艳,赵丽坤,李亚茹,张璇歌,成永强

(河北大学化学与环境科学学院,河北省分析科学技术重点实验室,

药物化学与分子诊断教育部重点实验室,河北保定 071002)

摘 要:基于水溶性氟硼二吡咯类共轭聚合物PBF可与长波长区(>600nm)荧光染料产生荧光共振

能量转移(FRET),结合引物延伸反应,发展了一种均相检测miRNA的新方法.方法首先通过引物延伸反应

在目标miRNA分子上引入荧光染料Cy5,形成miRNA-Cy5.然后,PBF与miRNA-Cy5/DNA杂合体通过

静电力结合并发生从PBF到Cy5的有效FRET,实现了基于阳离子共轭聚合物(CCP)的长波长区miRNA

的均相检测,方法灵敏度高、特异性好,测定miR-221的线性为15~6000pmol/L,检出限(3σ)为

8.4pmol/L.方法拓展了CCP的应用,为基于CCP的生物传感和生化分析提供了新的均相检测平台.

关键词:共轭聚合物;氟硼二吡咯;均相;miRNA

中图分类号:O657.39 文献标志码:A 文章编号:10001565(2019)03024707

HomogeneousdetectionofmiRNAbasedonboron-dipyrromethene

conjugatedpolymer

ZHANGJiangyan,ZHAOLikun,LIYaru,ZHANGXuange,CHENGYongqiang(KeyLaboratoryofMedicinalChemistryandMolecularDiagnosisofMinistryofEducation,

KeyLaboratoryofAnalyticalScienceandTechnologyofHebeiProvince,CollegeofChemistry

andEnvironmentalScience,HebeiUniversity,Baoding071002,China)

Abstract:Basedonboron-dipyrrometheneconjugatedpolymerPBF,whichcangeneratefluorescence

resonanceenergytransfer(FRET)withlong-wavelengthregion(>600nm)fluorescentdyes,anewhom-

ogeneousdetectionmethodformiRNAhasbeendevelopedbycombiningwithprimerextensionreaction.

Firstly,thefluorescentdyeCy5isintroducedintothetargetmiRNAbyprimerextensionreactiontoform

miRNA-Cy5.Then,PBFandmiRNA-Cy5/DNAhybridsarecombinedbyelectrostaticforceandtakeplace

effectiveFRETfromPBFtoCy5.ThehomogeneousdetectionofmiRNAinlong-wavelengthbasedoncat-

ionicconjugatedpolymer(CCP)isrealized,whichhashighsensitivityandspecificity.Thelinearrangefor

miR-221is15-6000pmol/L,andthedetectionlimit(3σ)is8.4pmol/L.Themethodexpandstheappli-

cationsofCCPandprovidesanewhomogeneousdetectionplatformforCCP-basedbiosensingandbio-

chemicalanalysis.

Keywords:conjugatedpolymer;boron-dipyrromethene;homogeneous;miRNA

收稿日期:20181020 基金项目:国家自然科学基金资助项目(21475031);河北省自然科学基金资助项目(B2018201049;B2017201184)

第一作者:张江艳(1986—),女,河北大城人,河北大学副教授,博士,主要从事分子诊断与肿瘤细胞杀伤研究.E-mail:hdzjy2005@163.com 通信作者:成永强(1972—),男,河北定州人,河北大学教授,博士,主要从事分子发光和生化分析研究.E-mail:yqcheng@hbu.edu.c

n 水溶性共轭聚合物主链由共轭结构组成,具有很强的光捕获能力[1].其侧链为易溶于水的离子官能团,

具有良好的水溶性及电解质的静电特性[2-4].其中,水溶性阳离子共轭聚合物(CCP)易与带负电荷的DNA/

RNA或蛋白质通过静电力结合,并可与荧光探针发生荧光共振能量转移(FRET),为生物大分子的分析和

检测提供了一种高效均相检测平台[5-11].Duan等[9-10]利用引物延伸反应引入荧光素标记的核苷酸,结合基于CCP的FRET技术,实现了基因单碱基突变的均相荧光检测.Song等[11]利用CCP与不同荧光染料(荧光

素,Cy3,德克萨斯红和Cy5)之间的多重FRET与双脱氧测序反应相结合绘制FRET指纹图谱,在均相溶液

中实现了DNA碱基突变的多重检测.但是,目前基于CCP的检测方法主要应用聚芴衍生物PFP,其最大激

发/发射波长为380nm/425nm.虽然PFP与荧光素和Cy3有很好的能量转移,但是其与Cy5、Cy5.5等长

波长区(>600nm)荧光染料之间的FRET效率很低,从而限制了CCP的应用.因此,发展适用于长波长区

的CCP及其分析检测新方法对于拓展CCPs的应用具有重要意义.

氟硼二吡咯(BODIPY)分子呈良好的共轭平面结构,具有高荧光量子产率.在共轭聚合物主链中引入BODIPY单元可使共轭聚合物的最大紫外吸收和最大荧光发射红移[12-14].Chong等[15]将BODIPY单元与芴

单元共聚结合,并在侧链引入季铵盐,制备了氟硼二吡咯类共轭聚合物PBF(图1a).PBF的最大激发/发射

波长为550nm/599nm(图1b),与长波区染料Cy5的吸收光谱有很好的重叠,符合FRET发生的条件,有

望用于长波长区的均相荧光检测.

miRNA是一类内源性小分子RNA,其异常表达与疾病的发生发展密切相关[16].其可作为肿瘤标志物

应用于临床诊断和治疗,因此发展miRNA的检测新方法具有重要意义[17-18].本文以miRNA为研究对象,通

过引物延伸反应使Cy5结合到miRNA分子上,基于PBF与Cy5之间的高效FRET,建立了一种均相检测

miRNA的新方法.

测PBF的激发光谱,发射波长为620nm;测PBF的发射光谱,激发波长为530nm;

测Cy5的激发光谱,发射波长为700nm;测Cy5的发射光谱,激发波长为570nm.

a.PBF的结构式;b.PBF激发光谱(1)和发射光谱(2)以及Cy5激发光谱(3)和发射光谱(4).

图1 PBF结构式与PBF及Cy5的光谱Fig.1 StructureofPBFandfluorescencespectraofPBFandCy5

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Klenow(exo-)DNA聚合酶、碱性磷酸酶购自ThermoFisherScientific(美国).RibolockRNase抑制剂

购自TaKaRa生物科技有限公司(大连).4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购自Sigma(美国).dUTP-Cy5购自

GEHealthcare(美国).实验中的氟硼二吡咯类共轭聚合物PBF按照文献合成[15].实验中寡聚核苷酸序列均

由TaKaRa生物科技有限公司(大连,中国)合成,序列如表1所示.实验中的所有溶液都是用去离子灭菌水842河北大学学报(自然科学版)第39卷第3期张江艳等:氟硼二吡咯类共轭聚合物均相检测miRNA研究

配制,其他试剂均为分析纯.

表1 实验所用探针及miRNA序列Tab.1 SequencesoftheprobesandmiRNAs

名称序列(5'-3')

probe-221CGATCAAAGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT

miR-221AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC

miR-222AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC

Let-7aUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU

Let-7bUGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU

Fluorolog3-211荧光光谱仪(HoribaJobin-Yivon,法国)用来测定荧光光谱,引物延伸反应在2720型热

循环仪(AppliedBiosystems,美国)中进行.

1.2 实验步骤

1.2.1 引物延伸反应

反应在20μL体系中进行,包含50mmol/LTris-HCl(pH=8.0),5mmol/LMgCl2和1mmol/L二硫

苏糖醇,4μL1μmol/Lprobe-221,适量的miR-221,20URibolockRNase抑制剂.该反应在2720型热循环

仪中进行,70°C加热3min,55°C保温90min,冷却至室温后,加入1.2μL5μmol/LdUTP-Cy5,2.5UKle-

now(exo-)DNA聚合酶,37°C反应1h,然后加入2.0U碱性磷酸酶,37°C温育10min,75°C反应5min.

1.2.2 荧光检测

反应完成后,取6μL反应产物,加入3μL10μmol/LPBF,191μL25mmol/LHEPES(pH=8.0),混

匀放置5min,进行荧光检测.激发波长为520nm,扫描范围为550~750nm,狭缝为8nm.

1.2.3 实际样品分析

HeLa细胞(人类宫颈癌细胞株)在含有体积分数10%胚胎牛血清的DMEM培养基中培养.用RNAiso

forSmallRNAKit试剂盒从HeLa细胞中提取SmallRNA样品,用紫外分光光度计定量.

2 结果与讨论

2.1 实验原理

以miR-221为检测对象,设计一条与miR-221互补的DNA探针probe-221.当溶液中有目标链miR-221

存在时,probe-221与miR-221杂交,然后在Klenow(exo-)DNA聚合酶的作用下进行延伸反应,使dUTP-

Cy5结合到miR-221的延伸产物中,形成miRNA-Cy5.加入PBF,PBF与miRNA-Cy5/probe杂合体双链通

过静电力作用结合,并发生从PBF到Cy5的高效FRET,使Cy5的荧光信号增强;当溶液中不存在目标链miR-221时,延伸反应不能进行,溶液中dUTP-Cy5用碱性磷酸酶处理成单核苷酸,其电荷较小,与PBF静

电引力较弱,不能形成有效的FRET,原理如图2a所示.

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[高分子材料] 复旦大学张凡《自然·通讯》：在近红外二区分子探针领域取得重要进展

[高分子材料] 复旦大学张凡《自然·通讯》：在近红外二区分子探针领域取得重要进展

复旦大学张凡《自然·通讯》：在近红外二区分子探针领域取得重要进展

2019-03-08

近日，复旦大学化学系张凡课题组开发出一类抗淬灭近红外二区小分子荧光探针，实现了活体小动物淋巴循环的高分辨率长时间成像和深组织穿透的pH传感，有望为生命科学及医学研究提供新的解决方案。相关研究论文“Anti-quenching NIR-II

molecular fluorophores for in vivo high-contrast imaging

and pH sensing” 3月5日在线发表于《自然·通讯》（Nature

Communications）。

(A) 抗淬灭近红外二区分子荧光探针设计；(B) 用于活体高分辨率淋巴成像；(C)

活体4毫米深度下进行胃酸的无创比率荧光传感分析；(D) 胃酸pH的精确解析。

小分子荧光探针是荧光成像与传感技术在生物医学研究中得以发挥重要作用的有力工具。近年来兴起的近红外二区（1000~1700

nm）荧光成像技术为该领域带来一次重大技术变革。相比于传统技术采用的短波段（400~900 nm）荧光，近红外二区荧光可显著降低生物组织的散射以及自发荧光干扰，因而极大地革新了成像分辨率和成像深度。然而限制该技术得以进一步发展的一个重要瓶颈是缺乏合适的小分子荧光探针。目前开发的荧光探针在水中普遍面临着荧光淬灭，光稳定性差等问题，并且缺乏荧光传感特性，在生物传感分析中应用受限。 针对上述问题，张凡教授研究团队打破聚集诱导荧光淬灭的传统惯性思维，发现溶剂极性增强是诱导荧光淬灭的主要成因，并基于此开发了系列波长可调的抗淬灭近红外二区花菁染料。与传统染料相比，该类染料在水中的荧光亮度提升了高达44倍，并获得了更优异的光稳定性，其活体淋巴成像效果远胜于金标准染料吲哚菁绿。与此同时，研究团队通过对染料光物理性质的深入研究，成功构筑了首个近红外二区pH传感探针，并将其应用于无创的4 mm组织深度下胃酸定量检测。在此过程中，研究团队克服了长期以来因组织内光衰减造成的活体荧光定量分析难的问题，提出了“波长分区比率荧光”定量分析方法。该方法利用两个在组织内衰减特征相似的荧光信号进行比率校正，同时结合体外模拟组织校正曲线，为活体内荧光定量分析提供了新的解决方案。

荧光材料在喹诺酮类药物检测中的研究进展

荧光材料在喹诺酮类药物检测中的研究进展

2019,28(6)福建分析测试 Fujian Analysis & Testing

17

荧光材料在唾诺酮类药物检测中的研究进展

杨 静，孙海阳，刘新宇，密丛丛*

(临沂大学化学化工学院，山东临沂276000)

摘要:哇诺酮类药物是一种人工合成的抗菌药物,随着其大量使用所引起的残留问题及对人体健康的威胁逐渐暴

露。本文介绍了近几年来荧光材料在唾诺酮类药物检测中的研究进展，并对未来发展的趋势与应用前景进行了展望。

关键词：哇诺酮类;检测;荧光

中图分类号:TB383

文献标识码:A

文章编号:1009-8143(2019)06-0017-04

Doi ： 10.3969/j. issn. 1009-8143.2019.06.04

Research Progress of Fluorescent Materials in Quinolones Detection

Yang Jing, Sun Hai-yang, Liu Xin-yu, Mi Cong-cong*

(School of Chemistry & Chemical Engineering, Linyi University, Linyi,Shandong 276000, China)

Abstract：Quinolones are synthetic antibacterial drugs. With the extensive use of quinolones, residual problems and threats

to human health are gradually exposed. In this paper, research progress of fluorescent materials in the detection of quino­

lones in recent years is introduced, and the future development trend and application prospect are prospected.

检测锌离子的荧光探针

检测锌离子的荧光探针

检测锌离子的荧光探针

姓名：徐英 学号：51007008 专业：应用化学

摘要：锌是人体必需的微量元素之一，是维持机体正常生长发育、新陈代谢的重要物质。锌的过量与不足都会导致人体代谢异常，产生疾病，因此，Zn2+含量的测定在临床、医药、食品、环境监测及科研中都有极其重要的意义。本文简要综述了测定细胞内游离锌离子荧光探针物质的化学规律、性质和优缺点。

关键词：Zn2+、荧光探针、定量检测

1、前言

在自然界元素的丰度顺序中，锌排在第25位，在地壳中的平均含量波动于0.004-0.02%之间。锌是位于元素周期表第II副族的过渡金属元素，具有3d104s2的价电子结构，通常只失去s电子而成+2氧化态。Zn2+的原子半径较小，且因其带两个正电荷，所以它对电子的亲和力很高，是一个强的质子受体[1]。

1940 年Eggleton首先提出人类需要锌[2]。Prasad和Sandstead 等研究明确了锌是人类必需的微量元素[3]。Zn2+是人体内第二富集的过渡金属，广泛分布于人体内部。

据研究表明，锌在许多生理、生化过程中发挥着极为重要的作用，例如:锌离子是组成三百多种生物酶活性催化中心的重要金属离子之一；它可作为金属蛋白酶的结构因子或转录因子；可以和许多调控酶相互作用，作为第二信使触发或阻断诸如细胞凋亡等重要生理过程；具有调控大量离子通道的能力，参与神经传导的过程；同时，锌离子在中枢神经系统（CNS）中还扮演着非常重要的角色。新近研究还表明，锌离子的浓度大小与多种疾病的发生紧密相关[4]。

缺锌对机体有重要影响: 一是对生长发育和组织再生的影响；二是对性器官和性功能的影响；三是锌依赖酶(含锌酶)的活性降低；四是缺锌可使胰岛素降解加剧，引起血中胰岛素水平下降及对葡萄糖利用率减少，葡萄糖耐量下降；五是缺锌可引起血液内视黄醇结合蛋白的浓度降低， 影响组织对维生素A 的利用，使人的暗适应能力下降，还有对皮肤及味觉等的影响[5]。虽然缺锌给人体带来了极大的伤害，但是人体内锌含量的超标也会造成同样大的伤害，如：补锌过量会使人的免疫力下降；可诱发人体的铜缺乏；过量补锌可降低机体内血液、肾和肝内的铁含量，出现小细胞低色素性贫血，红细胞生存期缩短，肝脏及心脏中超氧化物歧化酶等酶活性下降……[6]

近红外二区荧光探针的设计及应用研究进展

近红外二区荧光探针的设计及应用研究进展

第61卷 第1期厦门大学学报(自然科学版)Vol.61 No.1 2022年1月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Jan.2022

http:∥doi:10.6043/j.issn.0438-0479.202011026·综 述·近红外二区荧光探针的设计及应用研究进展黄艳芳,李子婧*(厦门大学公共卫生学院,分子影像暨转化医学研究中心,福建厦门361102)摘要:高时空分辨率和高灵敏度的荧光成像技术是一种新兴的活体可视化检测工具.与近红外一区(NIR-Ⅰ,700~900nm)相比,近红外二区(NIR-Ⅱ,1000~1700nm)成像具有更低的自发背景荧光、更深的组织穿透性和更高的信背比,因此NIR-Ⅱ荧光成像能促进深部疾病的精确诊断.NIR-Ⅱ荧光探针是NIR-Ⅱ荧光成像的基础.目前已开发一系列基于有机和无机材料的NIR-Ⅱ荧光探针,包括有机小分子染料、基于小分子染料的有机纳米粒子、共轭聚合物、量子点、稀土掺杂纳米粒子和单壁碳纳米管等.本文综述近期新型NIR-Ⅱ荧光探针的研究进展及其在生物医学领域的应用.关键词:荧光成像;近红外二区;荧光探针;有机小分子染料中图分类号:R445 文献标志码:A 文章编号:0438-0479(2022)01-0001-12

收稿日期:2020-11-16 录用日期:2020-12-09 基金项目:国家自然科学基金(81971674);福建省自然科学基金(2019J06006)*通信作者:zijing.li@引文格式:黄艳芳,李子婧.近红外二区荧光探针的设计及应用研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版),2022,61(1):1-12. Citation:HUANGYF,LIZJ.Researchprogressindesignandapplicationoffluorescenceprobesinthesecondnear-infraredwindow[J].JXiamenUnivNatSci,2022,61(1):1-12.(inChinese) 光学成像技术具有无创、安全、可视化能力强、空间分辨率高、成本低等优点,可对生物分子、细胞、组织和生物体进行实时、多维的可视化监测,是生物医学领域中的重要研究手段[1-2].荧光成像由于其灵敏度高、分辨率高及操作简单等优点,在生物分子检测成像、药物分布代谢跟踪、疾病检测和诊断,特别是癌症早期诊断和影像引导治疗中,具有良好应用前景.与可见光相比,发射波长在近红外区域的荧光探针可获得更深的穿透深度和更好的成像质量,因此,近10年来,荧光成像技术主要集中在近红外窗口.近红外一区(NIR-Ⅰ,700~900nm)荧光成像以其高灵敏度、快速反馈、无危害辐射、低成本等优点,在生物医学研究中受到广泛关注.例如,利用NIR-Ⅰ荧光染料可以精确地描绘前哨淋巴结/肿瘤轮廓,并在术中引导切除前哨淋巴结/肿瘤组织[3].最近的研究表明,由于具有散射少、组织吸收可忽略和自荧光效应最小化等优势,在近红外二区(NIR-Ⅱ,1000~1700nm)进行生物医学成像可以充分提高成像的时空分辨率(约20ms和约25mm)以及穿透深度(高达3cm),从而获得比NIR-Ⅰ更好的图像质量和更高的信背比[4-7].目前,临床批准的近红外荧光染料有两种,分别是吲哚菁绿(ICG,发射波长800nm)和亚甲基蓝(MB,发射波长700nm),两者都是可以快速排泄的小分子,主要用于NIR-Ⅰ成像[2].随着化学合成的不断发展,新的荧光材料不断被发掘.NIR-Ⅱ荧光材料种类也日益丰富,如有机荧光材料、量子点、稀土纳米材料等被开发应用于近红外生物医学成像.然而,缺乏良好的水溶性、稳定性、荧光效率和生物相容性等是NIR-Ⅱ荧光材料发展的瓶颈.如何解决这些问题是NIR-Ⅱ荧光成像领域的热点,也是未来发展方向[8-12].因此,开发荧光效率高、水溶性好、生物相容性好的新型NIR-Ⅱ荧光材料,对荧光成像技术的发展具有重要意义.本文对近期新型NIR-Ⅱ荧光材料的设计理念及其在生物医学领域的应用进行综述和展望,以期为NIR-Ⅱ荧光成像技术的发展提供参考思路.1 有机NIR-Ⅱ荧光探针目前,已经开发出多种性能优良的有机NIR-Ⅱ荧光材料,其具有明确的化学结构,并且易于代谢,生物相容性好[13],因此极具吸引力和发展前景,有望率先在未来的临床中应用.1.1 苯并双噻二唑(BBTD)类具有供体-受体-供体(D-A-D)特征的荧光团,如Copyright©博看网 . All Rights Reserved.厦门大学学报(自然科学版)2022年