药用植物内生菌的分离及抗菌活性的初步研究_杜慧娟

苍耳内生真菌的分离鉴定及抗菌活性研究
谢仰熹;刘先意;郭子强;孙卫明;许丽航;于平儒
【期刊名称】《现代食品科技》
【年(卷),期】2012(028)009
【摘要】从植物苍耳中分离内生真菌,选出8株进行抑菌活性测定,有6株对番茄早疫病菌抑制率大于50％.菌株SC008对5种植物病原菌的抑制率均大于50％.对内生真菌SC008进行形态学观察及ITS序列鉴定,初步判定菌株SC008归属于黑孢霉属(Nigrospora Zim.).碳氮源实验表明,SC008在以乳糖和蔗糖为碳源及以酵母提取物和牛肉膏为氮源的培养基上生长良好.
【总页数】4页(P1142-1145)
【作者】谢仰熹;刘先意;郭子强;孙卫明;许丽航;于平儒
【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006
【正文语种】中文
【相关文献】
1.苍耳提取液与植物内生真菌抗菌活性研究 [J], 祁力言;刘丽丽;于平儒;陈凤美
2.苍耳提取液与植物内生真菌抗菌活性研究 [J], 祁力言;刘丽丽;于平儒;陈凤美
3.白花夹竹桃内生真菌NR3次生代谢产物\r的分离鉴定及抗菌活性研究 [J], 孔阳;
马养民;关磊;周行;杜树荣
4.刺五加内生真菌分离鉴定及抗菌活性研究 [J], 刘悦;张爽;李佳宾;沈宏伟;崔红花;王振月
5.胡蔓藤内生真菌分离鉴定及抗菌活性研究 [J], 王嫒;吴智楠;周天赐;李佩琪;刘春梅;周迪;林洁
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第8期收稿日期:2012-06-12基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(81001381)作者简介:章华伟(1978-),男,安徽绩溪人,副教授,博士,主要从事生物制药教学与科研工作,(电话)0571-********(电子信箱)hwzhang@。

第52卷第8期2013年4月湖北农业科学Hubei Agricultural SciencesVol.52No.8Apr.,2013铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Mi⁃go)为兰科石斛属药用植物,主要分布在我国云南、浙江、广西、贵州等地区。

铁皮石斛具有抗肿瘤、抗辐射、抗血小板凝集、增强机体免疫力等功效,是我国传统的名贵中草药[1]。

随着需求量的日益增加,野生铁皮石斛被无序采集,自然资源日趋减少,部分种类已濒临灭绝。

植物内生菌作为一种重要的微生物资源,是植物微生态系统的重要组成部分,也是新型天然活性物质的重要来源之一[2]。

然而,在我国药用植物开发和利用中,对内生菌的研究相对较少,目前已研究涉及的药用植物内生菌只有300余种,这相对于我国丰富的药用植物资源(11146种)还相差很远。

因此,开展我国药用植物内生菌研究,特别是其生物多样性和化学多样性研究是非常必要的。

目前,关于铁皮石斛内生菌多样性的研究已有报道[3-6],但仅限于其内生真菌的研究。

研究采用形态学鉴定方法,系统分离铁皮石斛内生细菌,为丰富我国细菌资源和促进铁皮石斛保护性开发利用提供理论依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1植物来源新鲜健康野生铁皮石斛于2011年10月采自浙江天台山,保持整棵植株的完整性带回实验室,4℃保存,24h 内处理。

1.1.2培养基NA 培养基:牛肉膏3g,蛋白胨5g,葡萄糖2.5g,氯化钠5g,琼脂16g,去离子水1000mL;分离培养基:每毫升NA 培养基中加入100IU 两性霉素B,用于内生细菌分离纯化。

NB 培养基:牛肉膏3g,蛋白胨5g,葡萄糖2.5g,氯化钠铁皮石斛内生细菌的分离和初步鉴定章华伟,钟超群(浙江工业大学药学院,杭州310014)摘要:以野生药用植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo )为研究对象,采用无菌操作技术分离到内生细菌23株,其中来源于根、茎、叶的分别为7株、8株、8株。

第！6卷第6期曲靖师范学院学报V%!6 (%6 2017 年 11 月JOURNAL OF QUJI^^G NORMAL UNIVERSITY Nov. 2017滇龙胆内生真菌的分离及其抑菌活性研究宋艳秋1，刘卫红2(1.大理大学公共卫生学院;2.大理大学图书馆，云南大理671000)摘要:为了解云南道地药材滇龙胆内生真菌的菌落结构及代谢产物的抑菌活性，采用组织块法分离健康滇龙胆植株根、茎、叶中的内生真菌，并根据菌落和镜下特征对其进行初步形态学鉴定.并通过滤纸片法对分离得到的内生真菌进行抑菌活性筛选.从滇龙胆根、茎、叶中共分离到49株内生真菌，分 别属于15个属，其中有11属，23株对至少1种指示菌有抗菌活性，占总分离菌株的46.9%.本试验研究了滇龙胆内生真菌的种群分布，获得了一些具有抑菌活性的内生真菌，为寻找新的抗菌药物奠定基础.关键词：滇龙胆"内生真菌；抑菌活性中图分类号:S567.23 + 9;Q939.9 文献标识码:A 文章编号:1009 - 8879(2017)06 - 0033 - 04内生菌是一类生活在健康植物组织内或细 胞间隙，在它生活史的一定或全部阶段不引起宿 主明显病害的微生物[1].内生菌长期生存于植物 中，与宿主植物间不断进行着物质、能量及基因 交流，长时期协同进化，形成了互利共生，和谐对 抗的稳定的微生态[2].有研究认为，植物内生菌 的代谢产物具有抑菌、杀虫、促生长、抗肿瘤等多 种活性[!，4].因此，从植物内生真菌中寻找有用的 活性代谢产物已成为内生真菌研究的主流.滇龙胆是龙胆科龙胆属一种多年生草本植 物，集中分布于云南，是云南道地药材，在云药产 业开发中具有重要地位，其味苦，性寒，具有保 肝、健胃、抗炎、抗菌等作用[5]，野生滇龙胆资源 因过度挖掘开发，种群濒临消失.本实验对滇龙 胆内生真菌的菌落结构、分布规律以及抑菌活性 进行了研究，为获得具有较好抗菌活性的菌株，为滇龙胆的进一步开发利用提供理论基础.1材料与方法1.1材料1.1.1植物样品滇龙胆Franch)健康植株采自云南省临沧市云县茶房乡响水村，海拔1685米，由大理大学图书馆刘卫红博士鉴定认.1.1.2培养基利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)(含150#g/m L青霉素钾和120#g/m L硫酸链霉素）进行内生真菌分离;利用P D A培养基和促孢培养基进行菌种鉴定;利用马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)进行发酵;指示菌中细菌类采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌类采用P D A培养基培养.11.3指亦困(1) 革兰氏阳性细菌:1〇1(注:1〇1为菌株编 号）金黄色葡萄球菌（5=,J ococcl imreL)，107结核分枝杆菌（9yco#ac=r0* =6ercwio7)，124枯草芽抱杆菌(Eac0L 7#00);(2) 革兰氏阴性细菌：102大肠杆菌（>1a richia coK)，115铜绿色假单胞菌（：aer^icH a)，126 宋内氏志贺氏菌（5h0A a 7$- $A);(3)真菌：205白色念珠菌（Ca$80a aKi-ca$7,214 黑曲霉（？,.0〇7 $0a)，238 皮炎单收稿日期：2017-10-20基金项目：国家自然科学基金“内生菌对滇龙胆道地性的影响及其机制初步研究”（81102806);云南省基础应用基金“内生菌对滇龙胆品质的影响及其机制初步研究”（2011FZ166).作者简介：宋艳秋，大理大学公共卫生学院讲师，主要从事微生物学研究.第6期曲靖师范学院学报第36卷抱枝霉（Dormo8en8ram8erma=00)•上述供试指 示菌均由大理大学基础医学院提供.1.2方法1-2. 1内生真菌的分离和纯化用自来水将健康滇龙胆的根、茎、叶冲洗干 净后晾干，按照以下方式对植物进行表面消毒处 理:75%酒精浸泡2min(次氯酸钠溶液漂洗30 ~6〇s(无菌水冲洗数次[6].上述植物样品处理完后剪成0.2cm x 0.2cm长段（片）在无菌条件下置于分离用培养 基内，于28°C ±1°C条件下静置培养.培养5 ~ 10d后，挑取植物组织切口周围的菌丝转接入P D A斜面中进行纯化.1.2.2内生真菌的鉴定将分离到的内生真菌接入P D A培养基进行 插片培养，观察其菌落特征和镜下特征，参照文 献[7_8]将其鉴定到属.X#不产孢子的菌株转接入促孢培养基诱导 其产孢，仍然不产孢的菌株再通过水琼脂培养基 28 ± 1C培养1 ~5周.如还不能产孢，再利用黑 白光照交替的条件下28 ± 1C培养或不透光条 件下室温培养1 ~5周诱使其产孢[9].1.2.3内生真菌发酵样品的制备将内生真菌接种于10mL P D B培养液中，28C摇床（120 ~150r/mi n) 7天振荡培养，后加入等体积95%乙醇浸提48h后过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩近干，用无菌水定容至2m L制成发酵液样品.1.2.4抑菌试验(1) 取上述指示菌的新鲜斜面培养物分别 接入5m L无菌水制成菌悬液；(2) 采用滤纸片法(直径8mm).分别取9种 指示菌菌液各0.2mL，涂布于培养基表面，待凝固后放入浸有滇龙胆内生真菌发酵液的无菌滤纸片，细菌于（37 ±1)C，真菌于（28 ±1)C培养，48h后，测量抑菌圈直径.2 结果与分析2.1滇龙胆植物内生真菌的种群组成健康滇龙 株的 、、中化得到49株内生真菌，经鉴定，分别属于4目、5科、15属（见表1)，由此可见，滇龙胆内生真菌在种群组成上具有多样性特征.其中，毛壳菌属 CCaAo*0m最多，为10株，占总分离菌株的20. 4N，其次是头抱霉属Cephalosporium(14. 3N)和交链抱霉属？=raa.a(10. 2%).表1滇龙胆内生真菌的种群组成巨科属丛梗孢目丛梗孢曲霉属青霉属头孢霉属葡萄孢霉属雜帚霉属卵形孢霉属梗孢孢霉霉小单头孢霉属孢孢霉球壳孢目孢茎点霉属鹿角菌目菌菌无孢目组丝核菌属菌菌数量/分离部位根茎叶200 112 430 100 110 310 311 210 020 001 120 631 210 001 100由表1可知，滇龙胆不同部位的内生真菌在 离到的27株内生真菌，隶属于12属，无论在数数量、种群组成等方面存在较大差异.从根部分 量还是种类上均是最多的，占滇龙胆内生真菌总宋艳秋，刘卫红：滇龙胆内生真菌的分离及其抑菌活性研究数的55. 1%，从莲中分离到的16株内生真菌，隶 属于10属，占32.7%，从叶中分离得到的6株 内生真菌，隶属于5属，占12.2% .有些种群还 存在器官专一性，如曲霉属、葡萄孢霉属、组丝核 菌属、束丝菌属只从根中分离得到.2.2内生真菌的抑菌活性及活性菌株的分布采用滤纸片法检测49株内生真菌的代谢产 物对9种病原指示菌的抑菌活性，发现其中分属 于11个属的23株内生真菌对1种或多种指示 菌表现出一定程度的抗性作用，活性菌株数占滇 龙胆内生真菌总数的46. 9%(见表2).其中14株来自根，7株来自茎，2株来自叶.从表2可以看出，抑菌效果最为明显的是编 号为Ld23、Ld9和Ld10三株内生真菌，均来自滇 龙胆根部.其中Ld23菌株的抑菌谱较广，对9种 指示菌中的7种都具有抑制作用，抑菌圈直径在 10 ~ 16 m m范围内，且多次重复拮抗作用均较为 稳定.菌株Ld9和L d10均对6种指示菌有抑制 作用，其中Ld9代谢产物对金黄色葡萄球菌有较 强的抑制活性（V= 19);Ld10代谢产物对宋内氏 志贺氏菌抑制作用较强（V= 20mm).表2滇龙胆内生真菌的抑菌活性指示菌/抑菌圈直径（mm)困怀挪可101124107102115126205214238曲霉属Ld231013一1410121516一青霉属Ld5一18一一一1514一一Ld17一11一12一161311一头孢霉属Ld21一12一一13一一一一Ld29一一一111213一一一Ld40一一一13一11一12一卵形孢霉属Ld2一一13一一一一一一Ld37一9一1513一1218一孢霉Ld14一16一16一一一一一Ld1914一一一一一一13一Ld3512一一12一一一一一Ld919一15一10一111314小单头孢霉属Ld26一11一一一一一15一孢霉Ld42一11一1112913一一茎点霉属Ld10一一131315201413一Ld3412菌Ld1一一一一一15一一13 Ld33一一一13一12一一一Ld3915一11一一一一13一Ld48一一一10一一1113一组丝核菌属Ld6一一一一15一一一10 Ld111712一一一一1413一菌Ld47一一一15一一10一一注）：“一”：代表“无抑菌圈3讨论本实验从云南道地药材滇龙胆的根、茎、叶 中共分离纯化到49株内生真菌，分别属于4目、5科、15属，在数量和种类上，根、茎部明显多于 叶部组织.研究表明，内生菌可通过影响药用植物生长、特殊次生代谢产生和积累、抗逆性、内环 境等来影响药材的品质和道地性[10>12].滇龙胆 的主要有效成分是龙胆苦苷，云南不同产地滇龙 胆龙胆苦苷含量平均值为4.77%[13]，而地上部 分龙胆苦苷的平均含量则为1.95%[14].内生菌 种群在滇龙胆植株不同部位分布的差异，是否直 接影响了不同部位的龙胆苦苷含量，有待进一步第"期曲靖师范学院学报第卷研究.通过抑菌活性实验,获得了 23株具有抑菌 活性的内生真菌,分属于11属.为今后深入研究 其抑菌活性物质以及滇龙胆的进一步开发利用 奠定了基础.参考文献：[1 ] Stone J K, Bacon C W, White J. An overview of endo­phytic microbes &endophytism defined [ J ]. Microbial endophytes, 2000,3：29 -33.[2]陈美兰，黄璐琦，欧阳少华，等.植物内生菌对道地药材形成的影响[J].中国中医药信息杂志，2006,13(9) ：40-42.[3] Gimenez C, Cabrera R, Reina M, et al. Fungal endo­phytes and their role in plant protection [ J ]. Current Organic Chemistry, 2007, 11 ( 8) ：707 -720. [4] Kharwar R N, Mishra A, Gond S K, et al. Anticancercompounds derived from fungal endophytes ：their im­portance and future challenges [ J ]. Natural Product Reports, 2011, 28(7) ：1208 -1228.[5]张勇.龙胆苦甙药理研究进展[J].云南医药，1991,12(5) ：304 -305.[6]苗翠苹，余莹，陈有为，等.滇牡丹内生真菌的分离及其抑菌活性研究[J].中国药学杂志，2011,46(10) ：738 -741.[7]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979 ：405 -650.[8] H.L巴尼特，B. B亨特.半知菌属图解[M].沈崇尧，译.北京：科学出版社，1977：41 -197.[9]邵士成，吴少华，陈有为，等.云南元江印楝植物内生真菌的种类组成[J].生物多样性，2008, 16(1) ：63 -67.[10]贾敏，游飞，秦路平.内生菌药用新资源与道地药材的关系探讨[J].药学服务与研究，2009,9(5)：321 -324.[11] Schulz B ，Boyle C. The endophytic continuum [ J ].Mycological Research, 2005，109(6) ：661 -686. [12] Gao W W, Guo S X. Effects of Endophytic FungalHyphaeandTheirM etabolitesontheGrowthofDen-drobium candidum and Anoectochilus roxburghii [ J ].Acta Academiae Medicinae Sinicae, 2001,23 (6)：556 -559.[13]李智敏，赵磊，白艳婷，等.不同产地滇龙胆中龙胆苦苷的含量测定[J].云南中医学院学报，2008, 31(6) ：10-11.[14]赵磊，李智敏，杨俊，等.不同产地滇龙胆地上部分龙胆苦苷的含量测定[J].云南中医学院学报，2008, 31(5) ：23 -25.Isolation and Antimicrobial Acti^^it^ ofEndophytic Fungi from YunnanGentianaSong Yanqiu1!Liu Weihong2(1. College of Public Healtli,Dali University;2.Library,Dali University,Dali Yunnan, 671000, China)Abstract)I n order to understand the colony structure a nd antimicrobial activity of endop Gentiana in Yunnan,the endophytic fungi in root,stem and leaf of healt!iy Gentiana were isolated by tissueblock met!iod,their morjDhological identification was carried out according to colony and microscopic charac­teristics,and the antifungal activity of tiie isolated endophytic fungi was screened by filter paper metiiod. 49endophytic fungi were isolated f rom the roots,stems and leaves of Gentiana,belonging to 15 genera,ofwhich 11 genera and23 strains had antibacterial activity to at least 1indicative 46. 9%of the total Yunnan Gentiana.I n this study,the population distrilDution of end nan Gentiana was studied,a nd some endophytic fungi witii antimicrobial activity were obtained,which laid afoundation for the search for newantibacterial agents.Key words：Yunnan Gentiana;endophytic fungi；antimicrobial activity[责任编辑:崔萍]。

药用植物虎杖内生放线菌的分离及抑菌活性的研究陈文强;彭浩;邓百万;解修超;孔亚男;夏聪聪;刘兆迪;刘小红【期刊名称】《陕西理工学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(028)006【摘要】41 strains of endophytic actinomyeetes isolated from the Polygonurn cuspidatum in Qinba Mountains, China, were studied in this paper. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhl and Monilia albican were selected as indicator bacteria when the antimicrobial activities of these endophytic aetinomycetes were tested through antimicrobial experiments in the exterior body. The result showed that 13 strains can produce antimicrobial substances, which accounts for 31.7% of the total separates number. 5 strains of endogenous actinomyces have more obvious antibacterial activity. Bacteriostatic circle of PEA004 and PEA013 strains to Bacillus subtilis were 17 mm and 15 mm respectively, those two strains also show different degree of the antibacterial activity to several other indicator bacteria.%采用平板涂布法从药用植物虎杖(Polygonurn cuspidatum)中分离出内生放线菌41株,以大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella typhl)、白色念珠菌(Monilia albican)为靶标菌,采用滤纸片扩散法研究了虎杖内生放线菌发酵液的抑菌活性.结果显示,共有13株内生放线菌对5种靶标菌表现了不同程度的抑菌活性,占分离总数的31.7％.有5株内生放线菌表现出较明显的抑菌活性,特别是PEA004和PEA013菌株对枯草芽孢杆菌的抑菌圈分别达17 mm,15 mm,并且对其它几种靶标菌也表现出不同程度的抑菌活性.【总页数】7页(P61-67)【作者】陈文强;彭浩;邓百万;解修超;孔亚男;夏聪聪;刘兆迪;刘小红【作者单位】陕西理工学院生物科学与工程学院,陕西汉中 723000;陕西省食药用菌工程技术研究中心,陕西汉中 723000;陕西理工学院生物科学与工程学院,陕西汉中 723000;陕西省食药用菌工程技术研究中心,陕西汉中 723000;陕西理工学院生物科学与工程学院,陕西汉中 723000;陕西省食药用菌工程技术研究中心,陕西汉中723000;陕西理工学院生物科学与工程学院,陕西汉中 723000;陕西省食药用菌工程技术研究中心,陕西汉中 723000;陕西理工学院生物科学与工程学院,陕西汉中723000;陕西理工学院生物科学与工程学院,陕西汉中 723000;陕西理工学院生物科学与工程学院,陕西汉中 723000;陕西理工学院生物科学与工程学院,陕西汉中723000【正文语种】中文【中图分类】Q939.13+2【相关文献】1.药用植物鸦胆子内生细菌分离及其抑菌活性研究 [J], 梁子宁;赖开平;朱华;韦茂春;陈龙2.药用植物鸦胆子内生细菌分离及其抑菌活性研究 [J], 梁子宁;赖开平;朱华;韦茂春;陈龙;3.药用植物柽柳内生真菌分离及其抑菌活性初步研究 [J], 毕江涛;马萍;杨志伟;关晓庆4.秦岭药用植物防风内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究 [J], 张影珍;马养民;王鹏飞;田从丽5.4种药用植物内生放线菌的分离与初步研究 [J], 丁朋晓;曾庆华;罗森;李小琴;王玲红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

药用植物内生真菌分离及其次级代谢产物生物活性研究杨中铎;东建丽;赵维花【期刊名称】《西北师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(052)002【摘要】为分离药用植物中内生真菌，从次级代谢产物中筛选对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶有较高抑制率的提取物。

用分块法分离5种植物，马铃薯葡萄糖琼脂（PDA ）培养基纯化内生真菌，液体培养基发酵，用乙酸乙酯萃取菌液，甲醇提取菌丝体，用酶标法检测提取物对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶的抑制率。

共分离得到45株菌，制备了90种提取物，其中5株菌的菌液提取物对单胺氧化酶有不同程度的抑制率，露蕊乌头39（L RW T‐39）的菌液提取物对单胺氧化酶的抑制率最高，所有提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率不高。

表明药用植物内生真菌中存在抗单胺氧化酶的活性成分，值得进一步研究。

%Endophytic fungi is isolated from medicinal plants and higher inhibition rate of inhibition of monoamine oxidase(MAO) and acetylcholinesterase(AChE) are found from their secondary metabolites . Endophytic fungi is isolated by issue‐culture method and purified by potato dextrose agar medium . The fermentation of endophytic fungi are extracted by ethyl acetate , and the mycelium of endophytes are extracted by methanol to obtain methanol fractions . All fungi are tested for AChE and MAO inhibiting activity by colorimetric method in 96‐well microplates . Results sho w that 45 strains of endophytic fungi are isolated and extracted to obtain 90 extracts . Among them ,5 strains of Fungi exhibite significant anti‐monoamine oxidase activity . Theethyl acetate extract of LRWT‐39 are demonstrated to have most high activity against MAO . The active constituents in the endophytic Fungi of medicinal plants are worthy to be further studied .【总页数】5页(P79-83)【作者】杨中铎;东建丽;赵维花【作者单位】兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050;兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050;兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050【正文语种】中文【中图分类】R285.5【相关文献】1.药用植物内生真菌的分离及其次生代谢产物的生物活性研究 [J], 赵秋红;杨中铎;舒宗美2.药用植物内生真菌的分离及其次生代谢产物生物活性研究 [J], 裴英;杨中铎;李志忠;舒宗美;师音3.药用植物内生真菌的分离及其次生代谢产物的生物活性研究 [J], 丁海娥;杨中铎;舒宗美;师音4.药用植物内生真菌的分离及其次生代谢产物抗乙酰胆碱酯酶活性研究 [J], 杨中铎;周静怡;杨明俊5.一株红树尖瓣海莲内生真菌Penicillium sp.次级代谢产物及其生物活性研究 [J], 唐雄肇;黄国雷;周学明;李小宝;陈光英;郑彩娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

谢海伟，冯嘉琪，付晓晴，等．药用植物内生真菌的研究进展［Ｊ］．江苏农业科学，２０２０，４８（１４）：１－６．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２０．１４．００１药用植物内生真菌的研究进展谢海伟，冯嘉琪，付晓晴，江坤生，陈佳茹（惠州学院生命科学学院，广东惠州５１６００７） 摘要：植物内生真菌广泛存在于药用植物体内，具有丰富的生物多样性，对寄主植物有着积极的作用，内生真菌的次生代谢产物有着抗肿瘤、抗氧化、抗菌等活性，在医药、农业、食品等行业有着巨大的应用前景。

本文综述了近年来药用植物内生真菌的研究进展，在药用植物内生真菌的分离筛选技术、检测方法、鉴定技术等方面进行阐述，在药用植物内生真菌的种属多样性、代谢产物生物多样性方面进行分析；对药用植物内生真菌在医药行业和农业中的应用等进行总结，并对现今药用植物内生真菌的相关研究存在的问题进行分析，并对内生真菌的未来应用提出展望。

关键词：药用植物；内生真菌；分离筛选；多样性；应用 中图分类号：Ｑ９４９．９５；Ｓ１８２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２０）１４－０００１－０５收稿日期：２０１９－０７－２４基金项目：广东省级大学生创新创业训练计划（编号：２０１８１０５７７０５３、２０１８１０５７７００７）；广东省高校特色创新项目（编号：２０１７ＫＴＳＣＸ１７２）；惠州学院教授／博士科研启动经费（编号：２０１８ＪＢ００２）。

作者简介：谢海伟（１９７８—），男，吉林桦甸人，博士，教授，主要从事微生物、抗菌肽研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｅｈａｉｗｅｉ３２４＠１６３．ｃｏｍ。

药用植物内生真菌是天然药物的重要组成部分，其活性代谢产物丰富多样，包括各种结构类型独特、具有潜在应用前景的活性物质，已成为发现新高效、新颖、低毒的天然活性物质的重要资源。

目前发现内生真菌的种类多达１００万种［１］。

目前的主要研究集中于宿主植物与内生真菌共生机制和内生真菌天然代谢产物的功能关系等方面，植物内生真菌的次级代谢产物具有抗氧化性、抑制病原微生物、抗肿瘤、抗虫等功能，能被广泛应用于医药、农业、环境保护等方面。

药用植物内生真菌分离及其次级代谢产物生物活性研究杨中铎;东建丽;赵维花【摘要】为分离药用植物中内生真菌，从次级代谢产物中筛选对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶有较高抑制率的提取物。

用分块法分离5种植物，马铃薯葡萄糖琼脂（PDA ）培养基纯化内生真菌，液体培养基发酵，用乙酸乙酯萃取菌液，甲醇提取菌丝体，用酶标法检测提取物对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶的抑制率。

共分离得到45株菌，制备了90种提取物，其中5株菌的菌液提取物对单胺氧化酶有不同程度的抑制率，露蕊乌头39（L RW T‐39）的菌液提取物对单胺氧化酶的抑制率最高，所有提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率不高。

表明药用植物内生真菌中存在抗单胺氧化酶的活性成分，值得进一步研究。

%Endophytic fungi is isolated from medicinal plants and higher inhibition rate of inhibition of monoamine oxidase(MAO) and acetylcholinesterase(AChE) are found from their secondary metabolites . Endophytic fungi is isolated by issue‐culture method and purified by potato dextrose agar medium . The fermentation of endophytic fungi are extracted by ethyl acetate , and the mycelium of endophytes are extracted by methanol to obtain methanol fractions . All fungi are tested for AChE and MAO inhibiting activity by colorimetric method in 96‐well microplates . Results show that 45 strains of endophytic fungi are isolated and extracted to obtain 90 extracts . Among them ,5 strains of Fungi exh ibite significant anti‐monoamine oxidase activity . The ethyl acetate extract of LRWT‐39 are demonstrated to have most high activity against MAO . The active constituents in the endophytic Fungi of medicinal plants are worthy to be further studied .【期刊名称】《西北师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(052)002【总页数】5页(P79-83)【关键词】内生真菌;单胺氧化酶;乙酰胆碱酯酶;次级代谢产物【作者】杨中铎;东建丽;赵维花【作者单位】兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050;兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050;兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050【正文语种】中文【中图分类】R285.5乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE),是一个含有537个氨基酸的蛋白，通向酶活性中心的是一个细长、下端扩展的通道，也称“芳香峡谷”[1].它是通过减少突触间隙乙酰胆碱降解、增加突触间乙酰胆碱的可利用性，来治疗阿尔兹海默症.单胺氧化酶(Monoamine oxidase，MAO)是机体内参与胺类代谢的主要酶类，其活性高低与多种疾病如阿尔兹海默症、抑郁症、衰老等密切相关[2-3]，目前用抑制单胺氧化酶活性的方法治疗这些疾病.但所用的抗乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的药物毒副作用大，所以寻找新药刻不容缓.近年来，有关与植物有互利共生关系的植物内生真菌的研究越来越热门，它们产生的活性物质在生物防治和医药领域有巨大的应用潜力[4]，有关内生真菌在医学领域的报道主要与抗菌、抗肿瘤、抗氧化活性类物质和免疫活性物质相关[5].内生真菌是生活在健康植物组织内部且不引起植物产生明显病症的一类真菌.这类真菌生长在植物体的特殊环境中，不但可以促进宿主植物的生长发育，而且自身能产生许多活性物质，包括一些结构新颖的化合物[6].当前国内外对植物内生真菌的研究还处于初级阶段，所研究的植物对于庞大的内生真菌来说是一小部分，我国对内生真菌的研究比较晚，主要是菌的分离及生物活性研究[7].为了寻找具有抑制乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的活性物质，本文对露蕊乌头(Aconitum gymnandrum Maxim)、紫堇(Corydalis edulis Maxim)、翠雀(Delphinium grandiflorum)、高乌头(Aconitum sinomontanum Nakai)、甘青乌头(Aconitumtanguticum(Maxim)Stapf)5种植物的内生真菌进行分离，并检测其次级代谢产物对乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的抑制率，旨在为治疗阿尔兹海默症和抑郁症寻找有效而副作用少的新药奠定基础.露蕊乌头、翠雀、高乌头、紫堇、甘青乌头采自甘南草原，标本由兰州理工大学生命科学与工程学院杨林副教授鉴定.Wistar雌鼠购自兰州大学实验动物中心.pH=7.6，7.0,8.0磷酸盐缓冲溶液(PBS)；磷酸异丙烟肼(东京化工有限公司)、碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)、5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、乙酰胆碱酯酶(AChE，百灵威科技有限公司)、石杉碱甲(Huperzine -A)、4-氨基安替吡啉、辣根过氧化物酶、4-(三氟甲基)苄胺、香草酸(阿拉丁试剂公司).博迅SPX-100B-Z生化培养箱(上海博迅实业有限公司)、SHZ-82型恒温振荡培养箱(江苏省荣华仪器制造有限公司)、酶标分析仪DNM-9602、旋转蒸发仪RE-52(上海亚荣生化仪器厂).分离和纯化培养基：PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基+硫酸链霉素(200 mg·L-1).PDA培养基配法：马铃薯200 g·L-1，葡萄糖0.2 g·L-1，琼脂0.2 g·L-1.所有样品重复3次，结果计算取平均值.采用改进的Ellman方法[9,10]测定样品对乙酰胆碱酯酶的抑制活性.在96孔酶标板中，与单胺氧化酶相同设定组别.空白组依次加入160 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE(0.28 U·mL-1，pH=7.0 PBS溶解稀释)，本底组加140 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE和20 μL石杉碱甲(1 mg·mL-1)；阳性药组依次加入140 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE和20 μL石杉碱甲(6种不同梯度)，本底组加入155 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)和20 μL石杉碱甲；样品组依次加入140 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)，15 μL AChE和20 μL样品(1 mg·mL-1)，本底组加入155 μL PBS(0.1 mol pH=8.0)和20 μL样品.4 ℃孵育20 min，然后在各孔中加DTNB及ATCI各10 μL，37 ℃孵育20 min后在405 nm处用酶标仪测定其吸光度值.根据下式计算抑制率：抑制率(%)=[(空白组-完全抑制组)-(样品组-样品本底组)]/(空白组-完全抑制组)×100%.所有样品重复3次，结果计算取平均值.从露蕊乌头中分离到内生真菌25株，从翠雀中分离到内生真菌8株，从高乌头组织中分离到内生真菌5株，从紫堇中分离到内生真菌3株，从甘青乌头中分离到内生真菌4株(表1).表明药用植物中存在大量的内生真菌.用酶标法测定所有内生真菌提取物对单胺氧化酶的抑制率，结果显示(表2)，露蕊乌头中的2株(WT-39，WT-26-1)、高乌头中的2株(GWT-7，GWT-8)、雀翠中的1株(CQ-17)内生真菌发酵提取物具有强的单胺氧化酶抑制活性.内生真菌提取物用Ellman法测定抑制乙酰胆碱酯酶活性，得出提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率不高,其中抑制率最高的只有25%(表3).老年痴呆症亦称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，简称AD),即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、辨认等方面出现障碍.随着人口的老龄化，其发病率呈逐年上升趋势，因此对老年痴呆症的认识和治疗有重要的医学和社会意义[11].目前科学家提出的主要治疗方法是抑制乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的活性[12].但临床上所用的从天然药物中分离的几种乙酰胆碱酯酶抑制剂，如石杉碱甲、毒扁豆碱等毒性大、选择性低；单胺氧化酶抑制剂苯乙肼长期服用可使肾上腺素α2受体和β受体与递质的亲和力下降[13]；药用植物中的有效成分含量少，生长周期慢，资源匮乏.自1993年Stierle等[14]从短叶红豆杉(Taxussp andreanae)中分离到 1 株产抗癌药物紫杉醇内生真菌以来，从传统药用植物的内生真菌代谢产物中寻找新型活性物质成为内生真菌研究的主流[15].内生真菌与植物是互利共生的关系，这种共生的关系使双方在生理代谢和遗传基因表达方面都相互影响[16].一些内生真菌与植物共同生长，使这些内生真菌能够代谢产生与宿主植物相同或相近的生理活性成分[17].研究发现几乎所有的植物组织中都有内生真菌的存在[18]，平均每种宿主植物有 4～5 种专性内生真菌，按地球目前已知的30万种植物计算，内生真菌的总数可以超过100万种[19]，郭波等[20]就从抗癌药用植物长春花中筛选到4株能产抗癌药长春新碱的内生真菌.20世纪90年代，人们从微生物中获得乙酰胆碱酯酶抑制剂Cyclophostin，Arisugacin A,B 和 Territrem B,C[21]，周兰兰等[22]发现从白僵菌中提取的BCEF0083具有一定的抗单胺氧化酶的作用，丁海娥等[23]从药用植物的内生真菌中筛选出了16株对单胺氧化酶有不同抑制活性的内生真菌，2株对乙酰胆碱酯酶有活性的内生真菌.这些研究表明从药用植物中筛选对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶有抑制作用的内生真菌的方法可行.本研究利用已经成熟的菌种分离技术，对5种植物体的内生真菌进行分离，共得到45株菌，制备90种浸膏，通过生物活性测定，结果显示LRWT-L-39的粗浸膏对单胺氧化酶的抑制率最高，它的半抑制浓度达6.47 μg·mL-1，GWT-L-8的粗浸膏对单胺氧化酶的半抑制浓度达9.54 μg·mL-1, LRWT-L-26-1,GWT-L-7,CQ-L-17三株菌对单胺氧化酶的半抑制浓度也在30 μg·mL-1以下，说明这5株菌的次级代谢产物都可能有单胺氧化酶抑制剂的存在，通过跟踪分离有望得到新型的单胺氧化酶抑制剂.另外，发现植物内生真菌中抗乙酰胆碱酯酶活性成分较少，这与文献报道的结果一致.。

杜仲内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选
马养民;田从丽;张弘弛
【期刊名称】《时珍国医国药》
【年(卷),期】2011(22)3
【摘要】目的从药用植物杜仲的根茎叶中分离内生真菌,并进行初步鉴定和抗菌活性筛选。

方法经显微形态观察进行内生真菌的分离鉴定,采用菌饼法和纸片法进行抗菌活性筛选。

结果从杜仲植物中分离获得62株内生真菌,有47个菌株至少对1种指示菌具有抗菌活性,40株的代谢产物至少对1种指示菌具有抗菌活性,青霉属(Penicinium)的抗菌活性高且抗菌谱广。

结论杜仲植物内生真菌中广泛分布着有抗菌活性的菌株。

【总页数】3页(P552-554)
【关键词】杜仲;内生真菌;抗菌活性
【作者】马养民;田从丽;张弘弛
【作者单位】陕西科技大学教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室;山西大同大学农学与生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】R284.1;R285.5
【相关文献】
1.红树植物内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选 [J], 陈昭华;伍菱;杨秋明;王骥妍;朱敏佳;杜希萍
2.野生黄芩内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选 [J], 李青连;苏红;池维丹;崔晋龙;范黎
3.濒危植物七子花内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选 [J], 余文华;陈婷婷;邹园园;朱蔓莉;王丽君;张应烙
4.杜仲内生真菌的分离鉴定及抗菌活性研究 [J], 杨明琰;田稼;马瑜;孙超;黄继红
5.墨西哥仙人掌植物内生真菌的研究Ⅰ.内生真菌分离及其抗菌活性筛选 [J], 秦盛;陈有为;夏国兴;吴少华;张琦;李治滢;李绍兰;杨丽源;黄荣
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综述与编译050　内生菌与药用植物活性成分相关性研究进展陈雪英1　都晓伟1Ξ　李　滨2(11黑龙江中医药大学药学院　黑龙江哈尔滨150040;21黑龙江中医药大学教学实验中心　黑龙江哈尔滨150040)摘　要　从药用植物中提取分离出的内生菌的数量和种类不断增多,内生菌不仅自身能够产生活性成分,而且可以促进药用植物产生活性成分。

就近年来药用植物内生菌与活性成分相关性研究进展及存在的问题做一综述。

关键词　药用植物　内生菌　内生真菌　内生细菌　生物组合化学 内生菌(endop hyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部、不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物。

植物内生菌包括内生真菌和内生细菌(内生细菌包括内生放线菌),可从经过严格表面消毒的植物组织或植物组织内部分离得到[1]。

内生菌在植物体内广泛存在,从藻类、苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物中均已分离得到了内生菌,其分布于植物的根、茎、叶、花、果实和种子等器官组织的细胞或细胞间隙[2]。

1993年美国蒙大拿州立大学的Strobel小组首次从短叶红豆杉T ax us brev if olian N u tt.中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌,证明内生菌具有合成与宿主植物相同或相似的活性成分的功能[3]。

这一发现掀起了一场从药用植物中分离内生菌的热潮,并利用植物内生菌进行发酵生产得到了某些重要的天然药物,为解决某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等引起的药源匮乏和生态破坏问题提供了新思路。

近年来,科学工作者先后从数十种药用植物中分离得到了多种内生菌,并从这些内生菌的培养物中得到了与宿主植物相同或相似的活性成分。

概括起来,植物内生菌影响活性成分产生和积累的途径主要有两种,一是内生菌自身产生药用植物活性成分,二是内生菌促进药用植物产生活性成分。

1　内生菌自身产生活性成分从药用植物中分离得到的内生菌,经过人工培养,能够在培养物中产生某些植物活性成分。

吉林农业大学硕士学位论文常见药用植物内生菌根真菌抑菌活性及分子生物学的初步研究姓名：潘景芝申请学位级别：硕士专业：中药学指导教师：王琦20070501吉林农业大学穰士学位论文常见药用植物内生菌根真曹抑菌活性及分子生物学的初步研兜（２）菌丝体形态：细长，分枝，分隔，幼时无色，渐变为青褐色，褐色至暗褐色。

（３）分生孢子形态：孢子梗簇生或单生，淡褐色，直立，直或略弯，２２．０—６８．５Ｘ４．０—５．Ｏｐｍ；分生孢子短链生或单生，淡褐色至中度褐色，倒棍棒状（具明显假喙者），倒梨形或卵形（具短假喙或无喙者），具横、纵、斜隔膜，中部主横膜处明显隘缩，增厚，黑褐色，其他横膜处略隘缩，约３０％的孢子无喙，无喙孢子卵形或倒梨形，２３．０—３４．ＯＸ８．０—１２．Ｏｐｍ；大部分孢子向顶端渐细，延伸成喙，有些幼孢子已有明显的喙，成熟孢子倒棍棒形，基部钝圆（见图２－２）。

２．３．１．２菌种鉴定从桔梗根部分离得到菌落形态一致的链格孢菌，根据其形态特征，按《中国真菌志》（链格孢属）分类描述，初步鉴定为桔梗链格孢（Ａ抛砌砌ｐ砌ｙ∞咖西Ｔ．ＹＺｈａｎｇ）ｏ本实验所得之菌种与该描述相比，颜色、形状基本相同，分生孢子均多数保持中部１至数个主要横壁增厚，颜色渐深的特点，但原描述的分生孢子梗２５．０—７７．５×４．０—５．ｏｕｍ，分生孢子２５．５—３６．０ｘ９．５～１２．０ｐｒｏ，面本实验所得菌种的分生孢子梗为２２．０—６８．５×４．０—５．０ｐｒｏ，分生孢子为２３．０—３４．Ｏｘ８．０—１２．Ｏｌａｍ。

由此可见，原描述的分生孢子梗较本实验所得菌种的分生孢子梗要短，而且原描述的分生孢子也比本实验所得菌种的分生孢子要小。

田２—１桔梗内生菌撮真ＪＧｌｌ０２（桔梗链格孢）曹落形态ＦｉｅｆｌＴｈｅｃｏｌｏｎｙｏｆｅｎｄｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｐ／ｎｔｙｃｏｄｏｎｉｓ）ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＰｌａｔｙｃｏｄｏｎｇｒａｎｄｉｆｌｏｍｍＪＧｌｌ０２常见药用植物内生菌根真酋抑蕾活性及分子生物学的初步研究圈２－２桔梗内生菌根真ＪＧＵ０２（桔梗链格孢）孢子形杏Ｆｉｇ．２－２Ｔｈｅ啪谴ｈｏｆｅｎｄｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ（ＡＩｔｅｒｎａｒｉａｐｌａｔｙｃｏｄｏｎｉｓｌｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ只矿田哦ｆ勋ⅢｍＪ６１１０２２．３．２防风内生菌根真莆ＦＦ０１２１—根链格孢２．３．２．１形态特征（１）菌落形态：通常等径生长，暗褐色至黑色，边缘整齐，呈波状或裂片状，在培养基表面可以看到有黑色的孢子堆形成。