发酵工程实验(1)
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发酵工程实验指导
前言
发酵工程是整个生物工程的核心，是工业微生物实现实验室与工厂化生产的具体操作，是生物技术在生产实践中应用的原理及方法的一部分，是基因工程及酶工程等生物技术工业化的过程与方法。
同时随着生物技术的发展，发酵工程技术理论已广泛应用于生物制药技术、植物细胞培养及动物细胞培养技术等新兴领域。
因此，通过对发酵工程课程的学习，不仅掌握发酵工程原理及发酵优化控制过程，而且对系统了解生物技术及其工业化应用都具有深远的意义。
通过发酵工程实验及发酵工程各论的学习，不仅能够掌握发酵工艺操作的具体过程及反应过程控制方法，而且进一步了解目前发酵行业的具体产品生产工艺，对发酵生产能够进行指导与分析。
为学生将来进入研究生阶段的课题研究、进入发酵及相关行业工作以及新产品开发打下基础。
本实验根据发酵工程的共性技术选编了代表性的实验，涉及工业菌种分离、诱变选育、发酵过程优化、流加发酵技术、发酵罐使用及发酵实验等，基本上覆盖了发酵工程基本实验技术和发酵理论，其中主要以课题组研究成果为基础，通过对出芽短梗霉菌株的自然界筛选、富集、分离等手段，获得特定目的产物的高产菌株，大部分为创新性设计实验。
本实验指导可可用于制药工程专业微生物制药课程的实验指导参考，亦可应用于生物技术专业发酵工程课程的配套实验指导书。
课题组研究生阳静、李虹庆、李天夫等同学参与编写和指导，同时收集了与实验有关的参考书，供同学们参考。
发酵工程实验涉及水、电、气、蒸汽的使用及发酵设备安全操作，每位实验参与者应遵守实验室规章制度和实验要求。
实验一高产聚苹果酸菌株筛选分离
一、实验目的
（1）在自然界中筛选高产聚苹果酸的出芽短梗霉菌
株。
（2）掌握并学习筛选及鉴定出芽短梗霉的方法
二、实验原理
出芽短梗霉属于真菌界，半知菌门，丛梗孢目，暗色丛梗孢科，短梗霉属。
出芽短梗霉是一种腐生真菌，广泛存在于自然界中，出芽短梗霉在自然界中分布比较广泛，主要集中在植物叶片、花瓣、树皮以及海洋中，自然界分离到的不同亚种在各种培养条件下菌落形态有所差异，主要表现在不同色素和胞外多糖的分泌引起的变化，一般情况下，培养前期菌落圆润而粘稠随着菌龄增加会出现粉红
色、黄色或者黑色，菌落逐渐平整圆滑(图 1.2)。
目前，已分离到许多不同性状的出芽短梗霉，它们普遍能够合成普鲁兰多糖、聚苹果酸、各种胞外酶、葡萄糖酸、黑色素、单细胞蛋白等。
图 1.不同出芽短梗霉菌落表型及细胞形态
聚苹果酸（Polymalic acid , PMA）是由其单体苹果酸通过α位的-OH与α或β位的-COOH酯化而形成的新型聚酯化合物，根据酯键的位置差异分为α型β型和
γ 型三种构型（图 1.3）。
这三种构型都能通过化学方法合成，但分子量较小（≤17.4 kDa），条件苛刻；而生物法则只能合成β 型聚苹果酸。
聚苹果酸聚合单体苹
果酸是三羧酸循环（TCA）中的重要代谢中间体，很容易被生物体代谢利用，因此聚苹果酸具有非常好的生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性；由于聚苹果酸分子中带有很多外挂羧基，它具有很好的水溶性和可修饰性，方便将各种药
物靶标或载体连接到了-COOH上形成具有新功能的衍生。
三、实验材料
（一）仪器
超净工作台，灭菌锅，恒温摇床，恒温培养箱，250mL锥形瓶，显微镜，天平，pH计等。
（二）材料
1. 菌种与保藏
出芽短梗霉菌种从自然界采样分离，一般接种于PDA斜面4℃保藏。
2. 培养基
1） PDA 斜面培养基：2%葡萄糖，1%酵母膏，2%蛋白胨，2%琼脂粉
2）富集培养基：10%甘露醇，0.1%硝酸铵，0.05%KH2PO4, 0.02%MgSO4·7H2O，0.2%柠檬酸，0.02%司盘80。
3）筛选培养基：2%葡萄糖，0.2%NH4NO3，0.01%KH2PO4，0.05%KCl，2%琼脂粉，
0.02%MgSO4·7H2O，0.02%溴甲酚绿（pH6.0~6.5）。
4）种子培养基： 6% 葡萄糖， 0.2%NH4NO3， 0.05%KCl ， 0.01%KH2PO4，
0.01%MgSO4·7H2O，0.01%ZnSO4·7H2O，0.1%玉米浆，2%CaCO3。
5）发酵培养基： 9% 葡萄糖， 0.2%NH4NO3， 0.05%KCl ，
0.01%KH2PO4，0.01%MgSO4·7H2O，0.01%ZnSO4·7H2O，0.05%玉米浆，
3%CaCO3。
四、实验步骤
1. 采样
根据文献调研，高产聚苹果酸的出芽短梗霉分布广泛，可从海洋、桃树或樱花树等环境下分离。
该次选择在桃树或樱花等新鲜花朵、树蜜采集样本。
2. 富集与分离
将250mL三角瓶中加入20mL纯净水并加入玻璃珠，121℃灭菌20min中备用。
将采集的样本在无菌环境下放入无菌水中振摇20min后，将液体移取至装有20mL富集培养基的摇瓶中培养，220rpm，25℃培养直至液体浑浊。
将浑浊菌体按等比例稀释后，取100µL均匀涂布于事先制备好的PDA培养基平板上，置25℃烘箱倒置培养2~4d，定期观察菌落生长情况，挑取单菌落用革兰氏染色法染色后，油镜下观察细胞形态，确定单菌落只含有一种细胞形态，且符合出芽短梗霉椭圆状，若菌落不纯，需继续分离至单菌落。
3. 筛选
（1）初筛
用牙签蘸取单菌落点在筛选培养基上，25℃培养箱中培养2~4d，定期观察是否有黄色产酸圈。
以有明显黄色产酸圈的菌落继续后续研究。
挑取菌落于种子培养基中，25℃培养48h，
取发酵液上清液加入4倍体积无水乙醇，若有白色絮状沉淀，则可判定发酵液中可能有PMA。
采用HPLC法检测有絮状沉淀出现的发酵后离心液，将其中能产生PMA的做为初筛目的菌株。
（2）复筛
取初筛目的菌株经过二级培养，取发酵液离心水解后测定PMA含量，选择产量最高
的一株为复筛目的菌株，并保存于PDA斜面。
4. 菌株鉴定
（1）形态鉴定
将复筛目的菌株接种于PDA培养基平板上于25℃培养2d，观察菌落形态。
并取单
菌落用革兰氏染色法染色，油镜下观察菌株微观形态。
（2）分子鉴定
内转录间隔区（Internal transcribed sequence，ITS）包括18S和 5.8SrDNA中的ITS1及5.8SrDNA 和 28SrDNA 间的 ITS2。
18S、5.8S 和 28SrDNA 基因序列进化相当保守，但 ITS1
和ITS2为中度保守区域，使得种内相对一致，而种间存在明显差异，因而广泛用于种内
或属内物种间差异较明显菌群间的系统发育分析。
用改良CTAB法提取目的菌株基因组，以菌株基因组为模版，采用通用引物ITS4(5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3' )和 ITS5( 5' GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG 3' )，扩增核糖
体DNA的ITS序列。
经琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物后，用DNA纯化回收试剂盒回收PCR
产物进行测序（由北京六合华大基因科技股份有限公司完成）。
将测序结果提交至GenBank库进行Blast检索，采用MEGA6.06软件进行多序列匹配排列，构建系统发育树。
PCR 反应体系如下：
DNA 模版 1 µL
10×ExTaq Buffer 2.5µL
MgCl2（25mM）2µL
dNTP （各 2.5mM）2µL
ITS4 1 µL
ITS51µL
Ex Taq （5U/µL）0.125µL
ddH2O加至25µL
扩增程序为：
94℃3min
94℃35s
50℃50s 30cycles
72℃45s
72℃10min。
