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Selective extraction isolation of hemoglobin with ionic liquid 1 butyl 3 trimethylsilylimidazolium

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Available online at www.sciencedirect.comTalanta75(2008)1270–1278Selectiveextraction/isolationofhemoglobinwithionicliquid1-butyl-3-trimethylsilylimidazoliumhexafluorophosphate(BtmsimPF6)

De-HongCheng,Xu-WeiChen,YangShu,Jian-HuaWang∗ResearchCenterforAnalyticalSciences,Box332,NortheasternUniversity,Shenyang110004,ChinaReceived27November2007;receivedinrevisedform14January2008;accepted15January2008Availableonline1February2008

AbstractIonicliquidwasforthefirsttimeemployedforselectiveisolationofheme-proteinspecies.Directextractionofhemoglobinintoionicliquidwithoutusinganyconcomitantreagentorextractantwascarriedout.Hemoglobinatthelevelof100ng␮L−1couldreadilybequantitativelyextracted

intoionicliquid(IL)1-butyl-3-trimethylsilylimidazoliumhexafluorophosphate(BtmsimPF6)intheabsenceofanyco-existingextractants/additives

atpH7,atthesametime;however,theotherproteinspeciesdonotinterfereandremainintheaqueousphase.Abackextractionefficiencyofca.80%for20ng␮L−1hemoglobininionicliquidphasewasachievedwithsodiumdodecylsulfate(SDS)solutionasstrippingreagent.57FeMossbauerspectraandcirculardichroism(CD)spectraindicatedthatthepenta-coordinatedferrousatominhemoglobinprovideavacantorfreecoordinatingposition,whichcouldbeoccupiedbythecationicBtmsim+moiety.Theinteraction/coordinationreactionbetweentheironatominthehemegroupofhemoglobinandthecationicionicliquidmoietyfurnishesthedrivingforceforfacilitatingfasttransferofhemoglobinintoBtmsimPF6.Thepresentsystemwasappliedforselectiveisolationofheme-protein,i.e.,hemoglobinfromhumanwholebloodwithoutanypretreatment,givingrisetosatisfactoryresults.©2008ElsevierB.V.Allrightsreserved.

Keywords:1-Butyl-3-trimethylsilylimidazoliumhexafluorophosphate;Heme-proteins;Hemoglobin;Ionicliquid;Extraction

1.IntroductionTermedasgreensolvents,theionicliquids(ILs)haveattractedextensiveattentionbecauseoftheiruniqueproper-tiescharacterizedbyloworvirtuallynovolatility,negligiblevaporpressureandeaseofhandling,whichhaveshowngreatpromiseasanattractivealternativeorreplacementtoconven-tionalvolatileorganicsolventsandexhibitbio-compatibilitywhenemployedinbio-science.Inthepastdecade,roomtem-peratureionicliquidshavesuccessfullybeenappliedinthefieldsoforganicsynthesis,[1–4]biocatalysts[5]andextrac-tion/separation,[6–8]thelattercaseincludesisolationofvariousspeciesfromcomplexmatrices,e.g.,metalspecies,[9–12]organiccompounds[13]andbiologicalmolecules[14,15].Thehemeproteinsincludinghemoglobin,cytochromecandmyoglobinplayimportantrolesinnumerousbiologicalpro-

∗Correspondingauthor.Tel.:+8683688944;fax:+8683676698.

E-mailaddress:jianhuajrz@mail.neu.edu.cn(J.-H.Wang).

cesses,particularlythoseinvolvingtransportofoxygenandelectrontransferinlifeactivities.Lifescienceinvestigationsincludingproteomicanalysisrequirehighpurityofthesepro-teinsfreeofabroadrangeofimpuritiescoexistinginbiologicalsamplematrices.Therefore,separationandpurificationofspe-cificproteinspeciesfromreal-worldsamplematricesisamongthemostcriticalproceduresforlifesciencestudies.Arangeofextraction/separationproceduresforproteinisolationcanbelocatedintheliterature,[16–21]yetitisfrequentlyproblem-aticwhenadoptingconventionalorganicsolventsasextractionmediumduetotheirnaturaltoxicitytobiologicalmoleculesandlifeprocesses.Inthisrespect,theemploymentofionicliquidsasgreensolventsinanalyticalandbiologicalsciencesprovideapromisingalternative,whichhasdrawnconsiderableandincreasinginterest[22].Extractionofproteinsbyusingionicliquidwiththeassis-tanceofaconcomitantextractanthasbeeninvestigated[23].Sofar,however,thereisnoreportaboutthedirectextractionofproteinswithionicliquidintheabsenceofconcomitantextrac-tants,thismightbeattributedtotheverylimitedsolubilityofproteinsinionicliquids[24].Afewstudieshavebeendirected

0039-9140/$–seefrontmatter©2008ElsevierB.V.Allrightsreserved.doi:10.1016/j.talanta.2008.01.044D.-H.Chengetal./Talanta75(2008)1270–12781271totheactivitiesandstabilitiesofproteinorenzymespeciesinionicliquidphase,[25,26]whileinvestigationsaboutthecon-formation,activityandstabilityofproteinsinionicliquidswereblockedduetotheirlowsolubilities.Inthepresentpaper,wereportforthefirsttimethatheme-protein(hemoglobin,myoglobin)canreadilybeextractedintoionicliquid1-butyl-3-trimethylsilylimidazoliumhexaflu-orophosphate(BtmsimPF6),withoutusinganyconcomitantreagentorextractant.Ithasbeendemonstratedthatthefer-rousatominhemegroupofheme-proteinsprovidesavacantcoordinatingposition,whichofferspossibilitiesforcovalentcoordinationorinteractionbetweentheferrousatomandthecationicBtmsim+moietyintheionicliquidused,whichinturnfacilitatesthetransferofheme-proteinintotheionicliquidphase.2.Experimental2.1.ChemicalsProteinsusedinthepresentstudywereacquiredfromSigma(Louis,MO,USA),includingbovinehemoglobin(H2500),cytochromecfromhorseheart(C7752),myoglobin(0630),apo-myoglobin(A8673),transferrin(T3309),andbovineserumalbumin(A3311).ProteinMolecularWeightMarker(Broad)(TaKaRaBiotechnologyCo.,Ltd.,Dalian,China)wasusedaspurchased.Hexafluorophosphoricacid(KunshanFineChem-icals,Jiang-Su,China),1-chlorobutane(BeijingChemicals,China),1-methylimidazoleand1-trimethylsilylimidazole(KaileChemicals,Jiang-Su,China)wereusedasreceived.Otherchem-icalsemployedwereatleastofanalyticalreagentgradeandwereusedwithoutfurtherpurification.18M󰀅cmdeionizedwaterwasusedthroughout.2.2.ApparatusandmeasurementsProteinswerequantifiedbymeasuringtheirSoretpeaksusingaUV–visspectrophotometer(PurkinjeGeneralInstruments,Beijing,China).1HNMRspectraofthepreparedionicliq-uidswererecordedin(CD3)2COat293KonaBrukerAvance500spectrometer,withchemicalshiftsreferencedtotetram-ethylsilane(TMS).Thecirculardichroism(CD)spectrawererecordedonaJascoJ-810spectropolarimeter(JASCO,Japan)intherangeof200–550nm.Thespectrawereacquiredevery0.5nmwithabandwidthsettingof1nmatascanningspeedof100nm/min,witharesponsetimeof1sandaveragedfor3scans.ThefluorescencespectrawererecordedonanF-7000fluorimeter(Hitachi,Japan)withtheexcitationwavelengthat344nmandtheslitwidthsforexcitationandemissionsetat10nm.Roomtemperature57FeMossbauerspectraweremea-suredbyusinganFH-1918Mossbauerspectrometer(BeijingNuclearInstrumentFactory,China),witharoomtemperaturepalladiummatrixcobalt-57sourceandwascalibratedwithanatural␣-ironfoil.Thespectrawerefittedwithsymmetricquadrupoledoubletsbyusingastandardleastsquaresfittingprocedure.2.3.Preparationofionicliquids1-Butyl-3-trimethylsilylimidazoliumhexafluorophosphate(BtmsimPF6)waspreparedbyadoptingadocumentedpathwaywithminormodifications[27].1-Butyl-3-trimethylsilylimidazoliumchloride(Btm-simCl)wasfirstpreparedbythereactionof0.5mol1-trimethylsilylimidazoleand0.5molchlorobutanein50mLoftolueneinanitrogenatmosphereat90◦Cfor72hwithstirring

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包涵体的处理方法

包涵体的处理方法

关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。

对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。

4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

南开生化各章习题与答案

南开生化各章习题与答案

第一章蛋白质化学1．何谓蛋白质的等电点？其大小和什么有关系？2．经氨基酸分析测知1mg某蛋白中含有45ug的亮氨酸（MW131．2），23.2ug的酪氨酸(MW204.2)，问该蛋白质的最低分子量是多少？3．一四肽与FDNB反应后，用6mol/L盐酸水解得DNP－Val．及三种其他氨基酸。

当这种四肽用胰蛋白酶水解，可得到两个二肽，其中一个肽可发生坂口反应，另一个肽用LiBH4还原后再进行水解，水解液中发现有氨基乙醇和一种与茚三酮反应生成棕褐色产物的氨基酸，试问在原来的四肽中可能存在哪几种氨基酸，它们的排列顺序如何？4．一大肠杆菌细胞中含 10个蛋白质分子，每个蛋白质分子的平均分子量为40 000，假定所有的分子都处于a螺旋构象。

计算其所含的多肽链长度？5．某蛋白质分子中有一40个氨基酸残基组成的肽段，折叠形成了由2条肽段组成的反平行?折叠结构，并含有一?转角结构，后者由4个氨基酸残基组成。

问此结构花式的长度约是多少？6．某一蛋白样品在聚丙烯酸胺凝胶电泳（PAGE）上呈现一条分离带，用十二烷基硫酸钠(SDS)和硫基乙醇处理后再进行SDS－PAGE电泳时得到等浓度的两条分离带，问该蛋白质样品是否纯？7．“一Gly－Pro－Lys－Gly－Pro－Pro－Gly－Ala－Ser－Gly－Lys－Asn一”是新合成的胶原蛋白多肽链的一部分结构，问：1）哪个脯氨酸残基可被羟化为4一羟基脯氨酸？2）哪个脯氨酸残基可被羟化为3一羟基脯氨酸？3）哪个赖氨酸残基可被羟化？4）哪个氨基酸残基可与糖残基连接？8．一五肽用胰蛋白酶水解得到两个肽段和一个游离的氨基酸，其中一个肽段在280nm有吸收，且 Panly反应、坂口反应都呈阳性；另一肽段用汉化氰处理释放出一个可与茚三酮反应产生棕褐色产物的氨基酸，此肽的氨基酸排列顺序如何？9．研究发现，多聚一L－Lys在pH7.0呈随机螺旋结构，但在pH10为a螺旋构象，为什么？预测多聚一L－Glu在什么pH条件下为随机螺旋，在什么pH下为a螺旋构象？为什么？10．Tropomyosin是由两条a螺旋肽链相互缠绕构成的超螺旋结构。

生物工程下游技术思考题答案

生物工程下游技术思考题答案

一．绪论1、从某一动物培养的细胞中分离某一抗体(一蛋白的代表）的一般工艺过程。

答：生物工程下游技术的一般工艺过程（p12）2、分离纯化某一酶制剂的主要步骤和结果如下表：（（2）亲和层析的原理是什么？3、产品的分离提取工艺应考虑那些因素？答：生物分离过纯化过程的选择准则（P16）①步聚少，成本低②次序合理③产品规格（注射，非注射）④生产规模⑤物料组成⑥产品形式固体：适当结晶，液体：适当浓缩⑦产品稳定性⑧物性溶解度，分子电荷，分子大小，功能团，稳定性，挥发性⑨危害性⑩废水处理第二章发酵液预处理1．沉降速度离心的原理。

（p15）答：沉降速度法：主要用于分离沉降系数不同的物质。

2．沉降平衡离心的原理。

（p15）答：沉降平衡法：用于分离密度不同的物质。

如梯度密度离心。

3．差速离心的概念。

（p15）答：采用不同的转速将沉降系数不同的物质分开的方法。

4． rpm与RCF的换算关系。

5.已知某一离心机的转子半径为25cm，转速为1200r/min，计算相对离心力为多大？第三章细胞破碎1除去发酵液杂蛋白质的常用方法有那些？答：杂蛋白质的除去（p6）(1) 沉淀法：蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子（三氯乙酸盐、水扬酸盐）形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子（Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等）形成沉淀。

(2) 变性法：使蛋白质变性的方法很多，如：加热，调节pH，有机溶剂，表面活性剂等。

其中最常用的是加热法。

(3) 吸附法：加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。

2产品的分离提取工艺应考虑那些因素？答：(1) 是胞内产物还是胞外产物；(2) 原料中产物和主要杂质浓度；(3) 产物和主要杂质的物理化学特性及差异；(4) 产品用途和质量标准；(5) 产品的市场价格；(6) 废液的处理方法等。

3发酵液过滤与分离的困难的原因及解决方法。

答：第一节发酵液过滤特性的改变微生物发酵液的特性可归纳为： (P3)①发酵产物浓度较低，大多为1％一10％，悬浮液中大部分是水；②悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；③固体粒子可压缩性大；④液相粘度大，大多为非牛顿型流体；⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。

生化分离技术思考题答案解析1-6章

生化分离技术思考题答案解析1-6章

生化分离技术思考题答案解析生化分离第一章1. 简述生化分离技术在生物技术中的地位和主要作用。

2.生化分离技术的主要种类及特点。

种类：细胞破碎(cell disruption) 、沉淀分离(precipitation) 膜过滤(membrane filtration) 层析分离(chromatography)、电泳分离(electrophoresis)、离心分离（centrifugation）特点：成分复杂、含量甚微、易变性，破坏、具经验性、均一性的相对性3．何谓生化分离技术的集成化概念？请举例加以说明。

1) 利用已有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成) 2) 或把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。

如膜过滤与亲和配基、离子交换基团相结合，形成了亲和膜过滤技术、亲和膜色谱、离交膜色谱；亲和配基和聚合物沉淀作用相结合，形成亲和沉淀技术等等。

（P5）4.说明生化分离的主要步骤并指出胞内产物和胞外产物的分离纯化流程不同之处。

1选材，来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少2.提取：将目的物从材料中以溶解状态释放出来，方法与存在部位及状态有关。

3.分离纯化：核心操作，须据目的物的理化性质，生物学性质及具体条件定。

4.浓缩、结晶、干燥。

5、保存。

整个过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（收率、纯度）。

胞内产物需要破壁的过程：需要将目的物从胞内转移到外界溶液中，需要细胞提取物破碎、匀浆、离心，如果是液体的话，获得提取液，如果是想获得固体目的物，就对沉淀进行洗涤再获得提取物。

生化分离第二章1、简要说明常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。

答：常用的细胞破碎方法有：组织捣碎、珠磨法、高速匀浆法、挤压法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法、干燥法等。

1 组织捣碎，其原理是利用机械运动产生剪切力的作用破细胞，利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。