蛇床子超临界CO_2萃取后药渣中黄酮类成分的研究_典灵辉

167第11卷 第3期 2009 年 3 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 11 No. 3 Mar . ，2009

蛇床子Cnidium monnieri( L.) Cuss.是伞形科植物蛇床的干燥成熟的果实。主产于河北、浙江、江苏、四川等地。传统中药学认为蛇床子辛、苦，性温，有小毒，归肾经，有壮阳补肾，祛风燥湿，杀虫止痒之功效[1]。近年来，对蛇床子的研究主要集中在香豆素类成分，香豆素是一类极性较小的成分，是超临界CO2萃取的主要成分，萃取后的药渣作为废物弃去，为了充分利用药用资源，提高其附加值，有必要对其渣进行研究。经初步预试发现渣中含有黄酮类成分，黄酮类成分具有广谱的药理活性和较低毒性，己成为国内外天然药物开发研究的热点。但关于蛇床子中黄酮类成分的研究较少，为进一步开发利用蛇床子资源，因此对其黄酮类成分进行研究是一个具有重要意义的研究课题。本文采用颜色反应和色谱层析对蛇床子超临界CO2萃取后药渣中黄酮类成分进行定性鉴别，采用双波长分光光度法对其总黄酮进行含量测定，采用正交设计优选总黄酮提取的最佳提取工艺，为进一步开发利用蛇床子资源提供理论依据。1 仪器与试剂UV-1800PC型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；KQ5200 DB型数控超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）；ZF-20D暗箱式紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；旋转蒸发器RE-52A（上海亚荣生化仪器厂）；电子天平，芦丁对照品(中国药品生物制品检定所)，其他试剂均为分析纯。蛇床子超临界萃取后渣（广州美晨有限公司提供）。2 方法与结果2.1 黄酮类成分的鉴别2.1.1 颜色反应 本实验采用与盐酸-镁粉、三氯化铝、三氯化铁、醋酸镁、四氢硼钠和氢氧化钠反应对提取液中的黄酮类成分进行定性鉴定[2]。对蛇床子超临界萃取后药渣65％乙醇提取液进行定性鉴别的结果，见表1。表1 蛇床子提取液中黄酮的颜色反应盐酸-镁粉三氯化铝三氯化铁醋酸镁四氢硼钠氢氧化钠浅红色黄绿色褐绿色蓝紫色紫红色深黄，通入O2后变棕色从表1中可以看出，盐酸－镁粉反应颜色呈浅红色，这是黄酮类成分的特征反应，证明提取液含有黄酮类成分；三氯化铝反应呈黄绿色，进一步证明取液含有黄酮类成分；三氯化铁反应呈褐绿色，证明有5-OH黄酮或3-OH黄酮或二者都存在；醋酸镁反应呈蓝紫色，证明有二氢黄酮和二氢黄酮醇，因色泽较亮，推测结构中有5-OH；四氢硼钠反应呈紫红色，又证明提取液含有二氢黄酮；氢氧化钠溶液反应呈深黄色，通入O2后变棕色，说明提取液中含有黄酮醇。通过显色反应仅仅初步推断有黄酮类化合物，这为以后蛇床子中黄酮类化合物的进一步研究提供参考依据。2.1.2 纸层析 取供试品溶液点在滤纸上。用正丁醇：醋酸：水（4：5：1上层）为展开剂，上行展开5h，蛇床子超临界CO2萃取后药渣中黄酮类成分的研究典灵辉，吴 铁，于恩江（广东医学院，广东 东莞 523808）摘 要：目的：研究蛇床子超临界CO2萃取后药渣中黄酮类成分。方法：采用双波长分光光度法测定蛇床子总黄酮的含量，选择测定波长508nm，参比波长588nm；采用L9(34)正交试验优选蛇床子总黄酮的最佳工艺；并对提取液进行鉴定。结果：蛇床子超临界CO2萃取药渣中总黄酮最佳提取工艺为药材量25倍的65%乙醇溶液超声提取3次，每次30min。其总黄酮平均含量为11.685mg・g-1，RSD=1.43 %。结论：该工艺稳定可行。关键词：蛇床子；超临界CO2萃取；药渣；黄酮类成分中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2009)03- 0167- 03Study on Flavonoids of dregs in Cnidium monnieri( L.) Cuss.by Supercritical CO2 ExtractionDIAN Ling-hui, WU Tie, YU En-jiang（Guangdong Medical College, Dongguan 523808，Guangdong,China）Abstract：Objective: To study flavonoids of dregs in Cnidium monnieri( L.) Cuss. by supercritical CO2 extraction. Methods：A dual-wavelength spectrophotometry was applied to determine the total flavonoids of dregs in Cnidium monnieri(L.) Cuss. by supercritical CO2 extraction. The detective wavelength was 508 nm，while the reference one was 588 nm；The optimum condition of the ultrasonic extraction was investigated by L9(34) orthogonal design. And the preliminary identification of flavonoids of dregs was done by TLC chromatography and colour reaction. Results:The optimum process of the extraction is added 25 times amount of 0.5% alcohol and extracting for 30 min(totally extracting for 3 times).The average content of the total flavonoids is 11.685 mg・g-1(RSD=1.43%). Conclusion:The optimized process is stable and available.Key words：Cnidium monnieri(L.) Cuss.；supercritical CO2 extraction；dregs；flavonoids

收稿日期：2008-09-21作者简介：典灵辉（1970-），女，河南平顶山人，副教授，主要从事天然药物化学的教学与科研工作。168 辽宁中医药大学学报 11卷取出晾干，喷1%氯化铝乙醇溶液。吹干后可见光下观察，显灰黄色的斑点；于紫外光下观察，显天蓝色和黄色荧光；再将滤纸置于氨水上方薰1~2min后，立即在紫外光（365nm）下观察，原来显天蓝色荧光部分变为黄绿色荧光，黄色荧光变为更亮的黄绿色荧光，由此可以判断蛇床子超临界萃取后药渣中含量黄酮类成分。2.1.3 聚酰胺薄层层析 取芦丁、槲皮素对照品甲醇溶液和供试品甲醇溶液作为层析用样品溶液。将对照品溶液和样品溶液点于聚酰胺薄膜上，以甲醇-丙酮-苯(8：1：1)为展开剂展开，取出，挥去溶剂，喷以l%AlCl3乙醇溶液显色后，吹干，然后将聚酰胺薄膜于紫外灯下观察，芦丁、槲皮素对照品和供试品溶液均出现了黄绿色荧光斑点，但样品斑点与芦丁槲皮素对照品斑点位置不同。可知蛇床子中含有黄酮类物质，但不含芦丁和槲皮素。2.2 蛇床子总黄酮含量测定方法（双波长分光光度法）2.2.1 显色方法 精密称取对照品芦丁适量，加95％的乙醇配制为0.2022mg・mL-1的对照品溶液，备用。精密吸取对照品溶液10mL和样品溶液10mL，分别放置25mL的容量瓶中，加5％亚硝酸钠1.0mL，摇匀，静置6min；加10％的硝酸铝1.0mL，摇匀，静置6min；加4％的氢氧化钠10.0mL，用60％的乙醇释至刻度，摇匀，静置12min，以试剂空白为参比溶液，分别在不同的波长下测定其吸光度。2.2.2 测定波长和参比波长的选择 分别吸取10.0mL对照品溶液和10.0mL供试品溶液，按2.2.1方法显色，在400~700nm范围内进行光谱扫描，吸收光谱见图1。用双波长分光光度法测定单组分，可以选用显色络合物的最大吸收波长作为测定波长，而吸收光谱下端某一点波长可选作参比波长[3]，由此选508 nm 作为总黄酮含量的测定波长，588 nm为参比波长。2.2.3 标准曲线的建立 精确吸取芦丁贮备液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，分别置于25mL容量瓶中，按2.2.1方法显色。以1号作为参比液，在508 nm、588 nm处测定吸光度值，求出△A。以△A 对溶液浓度c(μg・mL-1)进行回归分析得方程A=6.8841C-0.0016，γ=0.9998。表明黄酮含量在8.088~56.616μg・mL-1之间浓度与吸光度呈良好的线性关系。 图1 芦丁溶液（A）和样品溶液（B）显色后的吸收光谱图 2.3 蛇床子超临界萃取后药渣中总黄酮提取工艺研究2.3.1 正交实验设计 为全面考察超声提取法对蛇床子超临界萃取后药渣中总黄酮提取效果的影响，笔者根据预试验结果进行分析认为，影响总黄酮提取的主要因素有乙醇浓度（A）、提取时间（B）、提取次数（C）和溶媒用量（D）。以总黄酮的含量为评价指标，选用L9(34)正交表对这4个因素进行综合考察，设计试验因素和水平，见表2。表2 试验因素、水平表L9(34)水平因素A（%）B（h）C（次）D（倍数）1652021527530320385404252.3.2 供试品溶液的制备 准确称取蛇床子超临界萃取后药渣1.00 g共9分，按表1试验条件进行提取，过滤，合并滤液，续滤液加60%乙醇定容至50 mL，得1~9号样品溶液，备用。2.3.3 正交设计实验结果分析 精密量取供试品溶液10mL,按2.2.1项下处理。采用外标法计算含量，其结果，见表3。表3 L9(34)正交试验方案与结果试验号ABCD总黄酮含量（mg・g-1）111116.455212227.208313337.038421236.721522316.260623126.254731324.866832134.577933214.934K16.9006.0145.7625.883K26.4126.0156.2886.109K34.7926.0756.0556.112R2.1080.0610.5260.229按方差分析理论得方差分析结果见表4。表明乙醇浓度、提取次数有极显著差异，溶剂量有显著差异，提取时间影响较小，当作误差。表4 方差分析结果方差来源偏差平方和自由度F比F临界值PA7.3062 1043.71419.000＜0.05B（误差）0.00721.0019.000C0.416259.42919.000＜0.05D0.103214.71419.000＜0.1由表3直观分析R值可知，最佳提取工艺是A1B3C2D3，即25倍药材量的65%乙醇超声提取蛇床子超临界萃取后药渣3次，每次40min。从方差分析结果可知，提取时间影响较小，为了节约能源和时间，将提取时间确定为30min，即最佳提取工艺是A1B2C2D3。2.3.4 验证试验 为确保提取工艺的重现性及可行性，按最佳提取工艺条件进行了3次验证试验，结果分别为11.535、11.663、11.861 mg・g-1，其平均值为11.685 mg・g-1，RSD=1.43%，重现性较好，说明提取工艺条件基本稳定。3 讨 论将蛇床子超临界CO2萃取后药渣的65%乙醇提取物，与盐酸-镁粉、三氯化铝、三氯化铁、醋酸镁、四氢硼钠和氢氧化钠反应均为阳性，同时纸层析、聚酰胺薄层层析也呈阳性，结果表明，蛇床子药渣中富含黄酮类成分，故可以将蛇床子药渣重新利用提取AB