第六章+分子生物学研究法(下)

现代分子生物学第六章作业

09级一班 芮世杭 222009317011027

1， 列举两种研究基因表达模式的方法并简述其原理。

（1）基因表达序列分析技术（SAGE）是一种以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术能够直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息在转录组水平上，任何长度超过9—10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性核苷酸的转录产物，因此，用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的9—10个碱基的核苷酸序列并制成标签。将这些序列标签连接，克隆，测序后，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。

（2）原位杂交技术（ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞，间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性标记的特异性探针与被固定的组织切片反应。若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，课通过反射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。

（3）基因芯片技术（ FISH）对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。

2， 简述基因芯片技术对分子生物学研究的意义。

解某些基因对特定生长发育阶段的重要性；基因芯片还可用于进行基因诊断，可建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图。用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活，另可研究表达基因的生物学特性。

3，比较酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术在研究蛋白质相互作用方面的优缺点？

（1）酵母双杂交技术称Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。

1 第五、六章 分子生物学研究方法练习题1

一、【单项选择题】

1.一般的限制性核酸内切酶II作用的特点不包括

A.在对称序列处切开DNA

B.DNA两链的切点常不在同一位点

C.酶切后产生的DNA片段多半具有粘性末端

D. DNA两链的切点常在同一位点，

E.酶辨认的碱基一般为4-6个

4.下列关于建立cDNA文库的叙述哪项是错误的

A.从特定组织或细胞中提取mRNA

B.将特定细胞的DNA用限制性核酸内切酶切割后，克隆到噬菌体或质粒中,

C.用逆转录酶合成mRNA的对应单股DNA

D.用DNA聚合酶，以单股DNA为模板合成双链DNA

5.限制性核酸内切酶的通常识别序列是

A.粘性末端

B.RNA聚合酶附着点

C.回文对称序列,

D.多聚腺苷酸

E.甲基化的“帽”结构

9.基因工程的操作程序可简单地概括为

A.载体和目的基因的分离、提纯与鉴定

B.分、切、连、转、筛，

C.将重组体导入宿主细胞，筛选出含目的基因的菌株

D.将载体和目的基因接合成重组体

E.限制性核酸内切酶的应用

11.常用质粒有以下特征

A.是线性双链DNA

B.插入片段的容量比λ噬菌体DNA大

C.含有抗生素抗性基因，

D.含有同一限制性核酸内切酶的多个切口

E.不随细菌繁殖而进行自我复制

14.表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是

A.大肠杆菌表达体系 B.原核表达体系

C.酵母表达体系 D.昆虫

E.哺乳类细胞表达体系，

18.在分子生物学上“重组DNA技术”又称为

A.酶工程 B.蛋白质工程 C.细胞工程

D.发酵工程 E.分子克隆技术

22.基因组代表一个细胞或生物的

A.部分遗传信息 B.整套遗传信息， C.可转录基因

D.非转录基因 E.可表达基因

25.在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是

分子生物学研究技术 Module 1:分子生物学研究技术

cDNA文库

cDNA文库，代表了生物体某一器官或组织mRNA中所有的或绝大部分的遗传信息。其构建过程总共有5个步骤（5项技术）：1、总RNA的提取；2、mRNA的纯化；3、cDNA的合成；4、cDNA文库构建；5、基因文库筛选。

详细：

1、总RNA的提取：目前常用的提取方法是异硫氰酸胍-苯酚提取法（Trizol提取法），提取步骤：（1）首先用液氮研磨材料成匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎并溶解细胞；（2）加入氯仿抽提，离心，收集含有RNA的水相；（3）用异丙醇沉淀，初步纯化RNA，获得样品用于下一步mRNA的纯化；（PS：实验中还常将含有RNA的细胞破碎物液通过硅胶膜纯化柱后，再通过低盐浓度下从硅胶膜上直接洗脱RNA，获得纯度较高的总RNA）；

总RNA的浓度、纯度测定：通过分光光度计测其OD260和OD280值，OD260为1时相当于RNA总量为40μg/ml；而OD260/OD280的比值如果在1.8~2.0之间，则表示所提取的RNA纯度较好。

2、mRNA的纯化：纯化原理，将真核细胞的mRNA分子具有5‘端帽子（m7G）和3’端poly（A）尾巴的特征结构，作为提取时的选择性标记。纯化提取方法：常用寡-纤维素柱层析法获，该方法利用mRNA3‘末端的poly（A）尾巴的特点，当RNA流经寡-纤维柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA或特异性结合到柱子上，之后再用低盐溶液洗脱mRNA，经过两次层析后可获得较高纯度的mRNA。

3、cDNA的合成：利用RT-PCR技术，常以oligo（dT）为引物，甲基化的dCTP（保证新合成的cDNA链被甲基化，防止构架克隆时被限制性内切酶切割）。合成基本过程：以mRNA为模板链，在逆转录酶的催化下以甲基化dCTP为原料合成第一条cDNA链；之后再以第一条cDNA链为模板，在DNA聚合酶催化下合成第二条cDNA（常用RNase H切割mRNA-cDNA杂链中的mRNA序列所产生的小片段为引物合成的第二条cDNA片段，再同过连接酶的作用连接成完整的DNA链。（PS：最后，cDNA两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得的cDNA具有方向性）

Molecular Biology 何志惠 - 1 - 分子生物学复习题

第一章 绪论

1、分子生物学概念及其主要研究内容。

①广义的分子生物学：是在分子水平上研究生命的重要物质的化学与物理结构、生理功能及其结构与功能的相关性，定量地阐明生物学规律，透过生命现象揭示复杂生命本质的一门学科。

狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因DNA的复制、转录、翻译和调控等过程，同时也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究基因的分子生物学。

②主要研究内容：DNA重组技术，基因表达调控，生物大分子的结构功能研究，基因组、功能基因组与生物信息学研究。

第二章 遗传物质基础——核酸

1、核酸是怎么发现的？

肺炎双球菌转化实验，Avery的体外转化实验，T2噬菌体感染实验，烟草花叶病毒的感染实验，Conrat烟草花叶病毒的重建实验。

2、作为遗传物质必须具备的条件是什么？

贮存并表达遗传信息，能把信息传递给子代，物理和化学性质稳定，具有遗传变化的能力。

3、简述DNA的二级结构及其特性？

(1)生物大分子主链周期性折叠形成的规则构象称为二级结构，即DNA螺旋。

(2)特性：①为右手反平行双螺旋；②主链位于螺旋外侧，碱基位于内侧；③两条链间存在碱基互补：A与T或G与C配对形成氢键，称为碱基互补原则（A与T为两个氢键，G与C为三个氢键）；④螺旋的螺距为3.4nm，直径为2nm ，每10个核苷酸形成一个螺旋。⑤含有大沟和小沟。

4、维持DNA二级结构的化学作用力。

①氢键：弱键, 可加热解链，氢键堆积, 有序排列(线性, 方向) 。

②碱基堆积力 (非特异性结合力)：范德华力，疏水作用力(不溶于水的非极性分子在水中相互联合, 成串结合的趋势力)。 Molecular Biology 何志惠 - 2 - ③带负电荷的磷酸基的静电斥力。

④碱基分子内能(温度升高使碱基分子内能增加时，碱基的定向排列遭受破坏)。