畜禽养殖场病原微生物气溶胶检测与防控研究进展

·HUNANAGRICULTURALSCIENCES畜禽养殖场病原微生物气溶胶检测与防控研究进展

舒燕1，王升平1,3，邬理洋1，曾艳1，周映华1,2，胡新旭1,2，高书峰1,2，，刘惠知1（1.湖南省微生物研究院，湖南长沙410009；2.湖南省农用微生物应用工程技术研究中心，湖南长沙410009；3.饲用微生态制剂湖南省工程实验室，湖南长沙410009）摘要：畜禽养殖场病原微生物气溶胶是养殖场畜禽呼吸道疾病发生的重要原因，给畜牧业生产带来了严重的危害，畜禽养殖场病原微生物气溶胶的检测方法主要有微生物培养计数、直接镜检、生物传感器技术、基因芯片技术、ＰＣＲ测序等。该项研究主要对畜禽养殖场病原微生物气溶胶的检测、危害及防控进行了综述；较全面地分析了空气微生物气溶胶检测方法，指出了畜禽养殖场病原微生物气溶胶检测方法的优缺点，及减少畜禽养殖场空气微生物气溶胶还待解决的问题；并提出绿色、安全、有效的病原微生物气溶胶防治手段将是今后该项研究的发展方向。关键词：病原微生物；气溶胶；防控；综述中图分类号：S856.3文献标识码：A文章编号：1006-060X（2014）19-0036-03ReviewofPathogenicMicrobialAerosolDetectionandPreventiononLivestockFarmsSHUYan1，WANGSheng-ping1,3，WULi-yang1，ZENGYan1，ZHOUYing-hua1,2，HUXin-xu1,2，GAOShu-feng1,2，LIUHui-zhi1（1.HunanInstituteofMicrobiology,Changsha410009,PRC；2.HunanEngineeringTechnologyResearchCenterofAgro-MicroorganismsApplication,Changsha410009,PRC；3.HunanEngineeringLaboratoryofFeedingMicrobioecologics,Changsha410009,PRC）Abstract：Pathogenicmicrobialaerosolonlivestockandpoultryfarmsisamajorcauseforanimalrespiratorydiseasesandhasdoneseriousharmtotheanimalhusbandryproduction.Detection,preventionandcontrolofpathogenicmicrobiologicalaerosolforthefarmswerereviewedinthisstudytoprovidecertainreferencesforpathogenicmicrobialaerosolcontrolinpractice.Keywords：pathogenicmicroorganism;aerosol;preventionandcontrol;review

微生物广泛存在于自然界中，各种微生物微粒如细菌、病毒、支原体、衣原体、立克次氏体等，悬浮于气体介质中形成的分散体系称之为微生物气溶胶。畜禽舍环境中的病原微生物气溶胶的存在可引起环境污染及气源性传染病的暴发流行，影响动物健康，同时危害人类。因此，针对畜禽舍环境中病原微生物气溶胶的研究对保障现代畜牧业健康发展意义重大。1畜禽养殖场病原微生物气溶胶的来源及危害动物本身是微生物气溶胶的主要来源。患病畜禽以及健康带毒畜禽可通过粪便，排出细菌和病毒，形成病原微生物气溶胶。尤其是在现代规模化、集约化饲养管理的畜禽养殖模式下，畜禽饲养密度高，畜禽舍内空气流动性差，极易形成微生物气溶胶。段会勇等（2008）运用肠杆菌基因间重复一致序列的聚合酶链式反应（ERIC-PCR）技术，对鸡舍大肠杆菌气溶胶传播进行了研究，发现鸡的粪便中分离到的大肠杆菌与从舍内空气中分离到的部分大肠杆菌相似性可达100%，从鸡场的下风方向分离到的大肠杆菌与从鸡舍空气、粪便中分离到的大肠杆菌相似性可达100%，表明畜禽舍内的气载大肠杆菌来源于动物粪便[1]。而钟召兵等（2008）用REP-PCR对鸡舍的金黄色葡萄球菌气溶胶进行了分析，也得出了相同的结论[2]。此外畜禽通过呼吸道排出的唾液、粘液等物中也含有大量病原微生物，它们也能形成病原微生物气溶胶，姚美玲等（2010）在对H9N2亚型禽流感病毒气溶胶发生实验中，发现SPF鸡感染H7N9病毒后可通过咽喉排毒，排出的病毒形成气溶胶[3]。畜牧业生产是病原微生物气溶胶的另一来源，目前，疫苗仍然是控制动物疾病的主要途径，活疫苗是病原微生物在人工条件下减毒而成，由于其所需的接种剂量小、免疫力持久，在我国兽用疫苗中得到了广泛的使用。通过滴鼻、气雾等免疫方式使用活疫苗时，如鸡新城疫Ⅱ系、Ⅳ系活疫苗及传染性支气管炎活疫苗等均常采用这种免疫方式[4]，可向空气散毒，同时疫苗强毒存在仍能引起畜禽感染并在呼吸道和消化道黏膜复制并排出，形成病原微生物气溶胶。2畜禽养殖场微生物气溶胶的检测收稿日期：２０１４－０８－０９基金项目：国家自然科学基金项目（３１３０２００３）；长沙市科技领军人才创新创业专项（Ｋ１３０７００６－２１）；作者简介：舒燕（１９８６－），女，湖南湘潭市人，助理研究员，主要从事动物健康养殖研究。通信作者：王升平畜牧兽医┃水产养殖┃产业研究

36湖南农业科学·目前可以用于微生物气溶胶检测的方法有很多，如微生物培养计数法、直接镜检法、生物传感器技术、基因芯片技术、PCR法等，这些检测方法的建立推动了畜禽养殖场微生物气溶胶研究的发展。（1）微生物培养计数和显微镜计数法是比较传统的微生物气溶胶检测方法，主要用于微生物气溶胶中微生物的定性检测与计数。微生物培养计数法是通过空气采样器采集样品，到特定的培养介质上进行培养，待培养结束后进行计数。目前国内大都应用此法进行气溶胶微生物检测，魏磊等（2012）利用此法在不同季节对鸡舍环境中气载需氧细菌及气载葡萄球菌的含量变化进行了分析[5]，但是此法费时、费力，且只能用于研究气溶胶中可培养微生物，对气溶胶中不可培养微生物则无法检测；据报道，空气中可培养微生物在10%以下，并且有的微生物培养时间比较长或者培养条件比较苛刻（如病毒），因此微生物培养计数法存在相当的局限性。（2）显微镜计数法或称染色计数法，是通过将微生物DNA用特定染料进行染色后，借助显微镜进行观察的一种微生物检测方法。4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色法已被认为是一种标准的测定浮游微生物总量的方法。刘敬博等（2010）分别采用直接培养法和DAPI染色法测定了畜禽养殖场鸡舍和猪舍环境内微生物气溶胶的浓度,发现通过培养计数法所测得的鸡舍浓度仅占DAPI计数法的1.63%~2.34%，猪舍培养出微生物浓度占DAPI染色计数法的1.93%。表明通过染色后的直接荧光镜检计数检测结果比培养计数法准确性更客观真实，不仅可以检测空气中活的微生物,还可以检测死细胞，是一种比较快捷简便的空气微生物检测方法[6]。（3）生物传感器是以生物学组件作为主要功能性元件，将特定的生物质浓度转换为电信号，并对其进行检测的仪器。当前的生物传感器因其识别元件不同，而主要有酶传感器、免疫传感器、微生物传感器和组织传感器、细胞传感器、DNA生物传感器等。美国在2000年就已经报道研制出了可检测肉毒杆菌等病原体的生物传感器，而Song等也制备出能够检测霍乱病菌的生物传感器[7]。生物传感器在较复杂的体系中能够进行快速连续监测，且具有高选择性、高灵敏度、低成本等优点，可以用于检测具有多个信号识别位点的病原体。因此生物传感器已成为最具潜力的微生物检测技术之一，并可应用到病原微生物气溶胶的检测之中。生物传感器法因其可对气溶胶微生物进行快速检测而在某些紧急情况下具有相当大的意义。（4）基因芯片技术是采用原位合成或显微点样技术将大量DNA探针分子固定于支持物表面,然后与标记样品杂交，通过对探针分子杂交信号的检测，进而获取样品分子的基因序列信息。基因芯片技术可实现对样品的高通量检测，所需检测时间短，特异性强。近年来基因芯片技术已成功应用于微生物如细菌、病毒、真菌的一些重要基因筛选检测、菌种鉴定研究等。曹三杰等（2007）构建了NDV-IBV-AIV-IBDV基因芯片，可同时检测家禽的几种主要气源性疫病病原体新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感病毒（AIV）和传染性法氏囊病病毒（IBDV），其检测灵敏性好，特异性高，检测结果也与RT-PCR方法基本一致[8]。李永强等（2009）以黄病毒属的日本脑炎病毒(JBEV)作为检测敏感性的模型,结合PCR技术，对基因芯片的敏感性进行了测定。发现人兽共患病病毒基因芯片至少可以检测出300ng的随机PCR产物核酸量，对病毒的检测敏感性与特异PCR检测敏感性相当。表明该人兽共患病病毒芯片技术达到了较高的检测敏感性，利用基因芯片技术检测病毒性病原体是可行的[9]。（5）PCR技术对病原微生物气溶胶的检测，是通过采样器采集空气的微生物样品，再经过DNA或RNA提取、PCR扩增和凝胶电泳图谱分析等达到检测微生物的目的。Fallschissel等（2009）通过实时定量聚合酶链反应（qPCR）来检测禽舍空气中的沙门氏菌，结果表明用qPCR检测沙门氏菌属气溶胶的可行性[10]。Chen等（2004）利用多重实时荧光PCR技术对SARS病毒进行了检测[11]，徐潜等（2005）分别用RT-PCR和病毒分离培养方法对空气样中SARS病毒进行了检测[12]。刘凡等（2011）利用巢式PCR对广东省四家医院空气微生物气溶胶进行了研究，表明利用PCR技术对空气微生物气溶胶进行检测可行[13]。PCR方法由于特异性强、操作简便，运用PCR技术可检测细菌和病毒的DNA，通过反转录PCR也可检测RNA病毒，其是最新发展的荧光定量PCR可对还可以实现对DNA或RNA的绝对定量分析，因此最近几年在空气微生物气溶胶的研究中使用越来越多，也显示了其在微生物气溶胶检测方面良好的应用前景。3畜禽养殖场微生物气溶胶的防控畜禽舍作为动物生活的地方，是病原微生物气溶胶产生的主要场所，因而也是养殖场产生效益、控制疾病感染的关键地方。而微生物气溶胶传播速度快，传播距离远，难于防御。国内对微生物气溶胶的防治一直以来依赖于传统的消毒剂和抗生素的使用，而新型无毒害、安全的畜禽舍病原微生物气溶胶防治方法研究还较少，主要集中在中草药空气消毒杀菌剂和拮抗益生菌的研制。（1）目前我国对病原微生物气溶胶的防控主要为化学消毒剂和抗生素的使用。化学消毒剂的使用可以通过杀死或抑制病原微生物的生长，从而减少畜禽疾病的发生和传播。常用的化学消毒剂有很多，如酸、碱、含氯化合物、醛类、酚类、季铵盐类等，消毒剂对畜禽舍病原微畜牧兽医┃水产养殖┃产业研究37·HUNANAGRICULTURALSCIENCES生物气溶胶具有广谱高效、价格较低廉、使用方便等特点，如氢氧化钠（烧碱），可用于气溶胶中烈性传染病病原体（如口蹄疫病毒等）污染畜舍环境的消毒，甲醛可用于畜禽舍环境的熏蒸消毒，杀死畜禽舍气溶胶中病原微生物。但是，化学消毒剂的毒性、刺激性对人和动物的健康有严重的损害作用，同时污染环境。如甲醛毒性大，有致癌作用，对使用者的健康有很大的危害，酸碱类消毒剂在使用过程中有一定的腐蚀性等，而某些过去曾被视为低毒或无毒的消毒剂，近年来却发现在一定条件下仍具有相当的毒、副作用。（2）防控畜禽舍病原微生物气溶胶的另一个方面是应用抗生素治疗患病畜禽，减少其对畜舍环境病原微生物的排放。但抗生素的大量使用甚至是滥用现象容易引起细菌耐药菌株的产生，甚至是超级细菌的出现，动物内源性感染和畜产品及环境药物残留等一系列问题，直接造成了动物免疫下降，真正发病时无药可用的尴尬局面，同时“有抗食品”直接危害人类健康，因此一种安全、环保的控制养殖场微生物气溶胶的可靠方法是人们所需要的。（3）中草药空气微生物消毒剂因其气味芳香，对人和动物无害，使用效果和常规化学消毒剂效果相当，是近年来人们开始关注的畜禽舍病原微生物气溶胶消毒剂。如朱艳（2010）使用艾叶、苍术喷雾剂对病房空气微生物的消毒效果进行了研究，发现艾叶、苍术喷雾剂能有效杀灭空气中微生物，具有良好的消毒效果，与过氧乙酸消毒组无显著性差异（P＞0.05）[14]，胡捷等（2013）使用中药制剂复方香艾液对室内空气消毒的效果进行了研究，发现复方香艾液进行气溶胶喷雾法能有效抑制空气中病原微生物，并能维持较长时间抑菌效果[15]。不过中草药空气微生物消毒剂也存在着一些不足之处，如中草药制剂提取工艺复杂，费用过高，效果有时不太稳定等，这些因素都制约着中草药空气微生物消毒剂的发展和推广应用。（4）近年来，微生物拮抗益生菌是除了中草药外的另一种绿色、安全的病原微生物气溶胶防控手段，微生物拮抗菌主要通过营养或空间竞争、分泌抑菌物质等方式来杀死或抑制病原菌的生长繁殖，减少疫病的发生，降低畜禽舍有害气体的排放，减少对环境的污染。仝永娟等（2013）将三株芽孢杆菌制成复合菌剂，针对复合制剂对鸡舍空气微生物的影响进行了研究，发现用复合芽孢杆菌喷洒鸡舍，与使用消毒剂有相似的功效，均能够有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长，与使用消毒剂组无显著差异（P＞0.05）[16]，同时还能改善鸡只健康，降低死淘率。拮抗菌多源于益生菌，拮抗菌以其无残留、绿色安全等优点逐渐替代抗生素，得到越来越多的关注、研究和应用，是畜禽舍病原微生物气溶胶防控可以考虑的新方法。同时通过改善动物卫生管理，对减少畜禽舍病原微生物、提高畜牧业生产水平和畜产品质量也有着十分重要的意义。4展望在现代的规模化畜禽生产体系中，集约化的现代养殖带来了生产效率的提高，但是畜禽环境中病原微生物气溶胶带来的危害也正在慢慢加大，畜禽舍病原微生物气溶胶导致现代养殖业中畜禽抗病力下降，甚至是发病死亡，在很大程度上制约了现代化畜禽生产的快速发展。我国对空气微生物气溶胶研究起步晚，主要侧重对空气中微生物气溶胶种类[17-19]、含量[20-21]及传播模式[22-24]的研究，研究还不够深入，对于微生物气溶胶的防治的研究较少，主要着重于传统化学消毒剂的应用；因此要想可持续发展现代畜养殖牧业，绿色、安全、有效的病原微生物气溶胶防治手段将是该领域今后发展的方向，这也是健康养殖、绿色养殖、生态养殖的必经之路。