(完整版)农杆菌介导法

发根农杆菌介导的原理发根农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤中常见的细菌，它具有突出的农业和生物技术应用潜力。

其主要特点是能够通过转座子（T-DNA）在植物细胞中插入外来基因，从而导致植物基因组的改变，进而实现基因工程研究和农业生产中的目标。

发根农杆菌介导的原理主要包括以下几个步骤：感知、转送、整合和表达。

首先，发根农杆菌通过感知植物寄主释放的信号物质，如根尖分泌的黄酮类化合物等，刺激其由游走态变为感染态。

这种感染态的农杆菌通过菌长的分裂和导向运动，定位并寻找到适合感染的植物细胞。

然后，农杆菌利用其菌体表面的一种称为T形胞器（T-pilus）的纤毛结构来与植物细胞发生物理接触。

这一接触后，细菌病原体释放一种羧酸感应蛋白（VirA）来感应植物信号，从而激活另一种蛋白质VirG。

VirG激活后，会诱导细菌病原体转录出一组称为Vir基因的透过激素（opine）类基因。

在接触并感应植物信号之后，发根农杆菌开始将其特有的Ti质体（tumor-inducing plasmid）插入到植物细胞中。

Ti质体是一种环状不稳定的DNA结构，其中含有T-DNA片段和一些辅助基因，如辅助合成植物激素的基因、抗生素抗性基因等。

这些辅助基因的存在有助于部分研究，但在基因工程中往往被删除以减小对植物基因组的影响。

最后，T-DNA片段与发根农杆菌质体DNA经由Vir蛋白复合物共运输进入植物细胞质内，然后通过核孔运输至植物细胞核中。

一旦到达细胞核，T-DNA片段会被整合进植物基因组中的染色体DNA或质体DNA中，此过程称为整合。

整合的T-DNA片段携带的外来基因在植物基因组中以遗传方式传递给下一代细胞。

实际上，发根农杆菌感染的结果对植物有很大的多样性。

当T-DNA的插入位置不幸地落在植物编码基因上，往往会导致基因不稳定、突变、失活等不可预测的结果。

然而，在合适的条件下，这种插入可以实现对植物的有益改造，例如抗病性、抗虫性、耐逆性等。

遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。

其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。

其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。

农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。

改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。

保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。

在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。

在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。

在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。

2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。

发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。

发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。

发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。

例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。

3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。

农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。

以上内容仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。

一、实验目的1. 掌握农杆菌介导植物遗传转化的基本原理和操作步骤；2. 了解农杆菌转化过程中的影响因素；3. 通过实验验证农杆菌介导植物遗传转化的可行性。

二、实验原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性土壤细菌，其Ti质粒（肿瘤诱导质粒）能够将外源基因导入植物细胞中。

Ti质粒上的T-DNA（转移DNA）片段能够插入到植物基因组中，从而实现外源基因在植物中的稳定遗传和表达。

三、实验材料1. 植物材料：拟转化植物的外植体（如叶片、茎段等）；2. 农杆菌菌株：含有T-DNA的农杆菌菌株（如LBA4404）；3. 转化载体：含有目的基因的载体（如质粒）；4. 培养基：MS培养基、诱导培养基、选择培养基等；5. 试剂：抗生素、酶、DNA标记物等。

四、实验步骤1. 构建转化载体：将目的基因克隆到载体上，构建含有T-DNA片段的转化载体。

2. 农杆菌活化：将农杆菌菌株接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜。

3. 外植体消毒：将外植体在70%乙醇中浸泡30秒，然后在无菌水中清洗3次，最后在无菌条件下用无菌刀片切取适当大小的外植体。

4. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与外植体在MS培养基上共培养，使农杆菌感染外植体。

5. 诱导再生：将转化后的外植体接种于诱导培养基上，诱导再生丛生芽。

6. 选择转化植株：将再生丛生芽在含有抗生素的选择培养基上培养，筛选出转化植株。

7. 鉴定转化植株：通过分子生物学方法（如PCR、Southern blot等）鉴定转化植株。

五、实验结果与分析1. 农杆菌转化频率：实验结果表明，农杆菌转化频率较高，转化植株数量较多。

2. 转化植株的遗传稳定性：通过分子生物学方法鉴定转化植株，发现转化植株的遗传稳定性较好，目的基因在植物基因组中的插入位置和拷贝数稳定。

3. 转化植株的表达：转化植株中目的基因的表达水平较高，达到预期效果。

六、实验结论通过农杆菌介导植物遗传转化实验，成功地将目的基因导入植物细胞中，实现了植物遗传改良。

农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。

2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。

二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。

农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

实验一培养基配制一、仪器和试剂1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台2、药品：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L ，Yeast extract (酵母提取物) 1g/L ，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar (琼脂) 1.5g/100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），链霉素（str）。

二、实验方法第一组配制YEB固体培养基1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract (牛肉浸膏)；1.25g Peptone (蛋白胨)；0.25g Yeast extract (酵母提取物)；1.25g Sucrose (蔗糖)；1g MgSO4.7H2O；琼脂粉3.75g；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml，用NaOH调pH=7.4。

称，用高压灭菌锅进行灭菌。

3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100μg/ml kan+50μg/ml Str+50μg/ml rif），以免温度过高导致抗生素失效。

《外源基因导入真核细胞的基本方法》外源基因导入真核细胞是现代生物技术中的一项重要技术。

方法一：农杆菌介导法。

农杆菌是一种土壤细菌，它可以将自己的Ti 质粒上的一段DNA（T-DNA）转移到植物细胞中，并整合到植物细胞的基因组中。

利用这一特性，可以将外源基因插入到Ti 质粒的T-DNA 中，然后通过农杆菌感染植物细胞，将外源基因导入植物细胞的基因组中。

例如，在转基因植物的研究中，经常使用农杆菌介导法将外源基因导入植物细胞中。

方法二：基因枪法。

基因枪是一种利用高压气体将包裹有外源基因的金属颗粒加速，然后射入真核细胞中的设备。

基因枪法可以将外源基因导入各种真核细胞中，包括植物细胞、动物细胞等。

例如，在一些动物细胞的转基因研究中，使用基因枪法可以将外源基因导入动物细胞的基因组中。

方法三：电穿孔法。

电穿孔法是利用高压电场在细胞膜上形成小孔，使外源基因能够通过这些小孔进入细胞中。

电穿孔法可以将外源基因导入各种真核细胞中，并且操作相对简单。

例如，在一些细胞培养实验中，使用电穿孔法可以将外源基因导入细胞中，进行基因功能的研究。

方法四：脂质体转染法。

脂质体是一种由磷脂双分子层组成的微小囊泡，可以将外源基因包裹在其中。

然后，通过与真核细胞融合，将外源基因导入细胞中。

脂质体转染法具有转染效率高、对细胞毒性小等优点。

例如，在一些基因治疗的研究中，使用脂质体转染法将治疗基因导入患者的细胞中。

方法五：病毒载体法。

利用病毒作为载体，将外源基因导入真核细胞中。

病毒可以感染真核细胞，并将自己的基因组整合到细胞的基因组中。

将外源基因插入到病毒的基因组中，然后利用病毒感染真核细胞，就可以将外源基因导入细胞中。

例如，在一些基因治疗的研究中，使用腺病毒、慢病毒等作为载体，将治疗基因导入患者的细胞中。

农杆菌介导的油菜遗传转化操作流程一、所需试剂母液配制方法1. MS母液配制方法见小孢子培养部分。

2. 6-BA（6-苄基嘌呤）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 6-BA用微量HCl溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。

3. NAA（α-萘乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g NAA用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。

4. 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 2,4-D用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。

5. AgNO3：称取0.5 g AgNO3溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤。

6. AS（乙酰丁香酮）：溶解于DMSO（二甲基亚砜），母液浓度为100 mM，0.22 μm有机系滤膜过滤，分装成小份保存。

7. Kan（卡那霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。

8. Carb（羧苄青霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22 μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。

9. Cef（头孢霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。

二、操作流程1. 无菌受体材料的准备选取饱满、干净的油菜种子用75%乙醇浸泡1 min，然后在0.1%升汞中灭菌10~15 min，无菌水冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干多余的水分，接种于1/2 MS（添加10 g/L 蔗糖，0.7 % 琼脂，pH 5.8）培养基上，25~28℃下暗培养，待种子萌发再移至光下培养，光照16 h/d，强度2000 lx左右。

2. 受体材料的预处理取4~6 d的无菌苗子叶或下胚轴作为转化受体。

用解剖刀切下完整的子叶（带1~2 mm子叶柄）或下胚轴（5~10 mm），将切下的外植体置于预培养基（MS +30 g/L 蔗糖 + 0.7% 琼脂 + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D，pH 5.8）上进行预培养2~3 d，材料切口处刚开始膨大时即可进行接种浸染。