下载文档原格式
丙酮丁醇梭菌代谢工程菌的构建及其发酵性能方雪;刘刚;邢苗;王绍文【摘要】丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum可以利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖等多种底物,发酵糖获得丙酮、丁醇、乙醇等产物,是一种优良的木质纤维素同步糖化发酵菌种.为获得具有更优良发酵性能的木质纤维素发酵菌株,使用代谢工程技术对丙酮丁醇梭菌进行改造.将乙酰乙酰CoA硫解酶基因(thl)的启动子和末端两个同源片段以及醛/醇脱氢酶基因(adhE)的开放阅读框连接到pUC18上,构建成整合型质粒pTAEE,电转化丙酮丁醇梭菌后在红霉素抗性平板筛选转化子.通过PCR扩增及产物序列分析表明,质粒pTAEE中的adhE基因以单交换的方式整合到转化子基因组中,增强adhE的表达.重组菌T4的乙醇得率为2.3％,比野生菌提高了15％,乙醇浓度为0.39 g/L,与野生菌相当；丁醇得率为41.6％,比野生菌提高了69％,丁醇浓度为6.9g/L,比野生菌提高了41％,获得了发酵性能更高的丙酮丁醇梭菌代谢工程菌株.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2014(040)002【总页数】7页(P99-105)【关键词】丙酮丁醇梭菌;代谢工程;整合型质粒;丁醇【作者】方雪;刘刚;邢苗;王绍文【作者单位】深圳大学生命科学学院,深圳市微生物基因工程重点实验室,广东深圳,518060;合肥师范学院生命科学系,安徽合肥,230601;深圳大学生命科学学院,深圳市微生物基因工程重点实验室,广东深圳,518060;深圳大学生命科学学院,深圳市微生物基因工程重点实验室,广东深圳,518060;深圳大学生命科学学院,深圳市微生物基因工程重点实验室,广东深圳,518060【正文语种】中文正在显现的石油危机引起了各国对未来能源供应不足的普遍关注，并促使人类寻求可再生的燃料来代替化石燃料［1］。
木质纤维素是世界上最丰富而又未得到充分利用的可再生资源，以木质纤维素为原料发酵生产燃料乙醇和丁醇是解决燃油短缺的重要途径［2］。
2017年第36卷第4期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS·1395·化 工 进展发酵法生产1,3-丙二醇的研究进展李晓姝，张霖，高大成，师文静，樊亚超（中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院，辽宁 抚顺113001）摘要：1,3-丙二醇是一种重要的化合物，近年来由于其用途的不断拓宽而越来越受到广泛重视。
生物合成法生产1,3-丙二醇具有绿色高效、使用可再生能源等特点，是目前最具前景的生产方式。
本文从发酵菌种、发酵工艺、发酵过程优化和精制提纯几个方面对发酵法生产1,3-丙二醇的研究现状进行了介绍。
提出为使生物法生产1,3-丙二醇在成本上与化学法相比更具优势，在提高产量的同时应该引入新技术、新手段对发酵过程进行强化，使得过程更加精准且易于控制；同时指出综合考虑经济性与能耗问题，对发酵与分离的全过程进行整合，是今后发酵法生产1,3-丙二醇实现产业化的研究重点。
关键词：1,3-丙二醇；发酵；生物转化；甘油中图分类号：TQ 923 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2017）04–1395–09 DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2017.04.032Progress on the production of 1,3-propanediol by fermentationLI Xiaoshu ，ZHANG Lin ，GAO Dacheng ，SHI Wenjing ，F AN Yachao（Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals ，SINOPEC ，Fushun 113001，Liaoning ，China ）Abstract ：1,3-propanediol is an important chemical compound ，which has recently received more andmore attention due to its wide applications. Synthesizing 1,3-propanediol via the biological method has some merits ，such as green ，high efficiency ，and sustainable. This method is the most promising for the 1,3-propanediol production.In this paper ，the research advances on production of 1,3-propanediol by fermentation were reviewed with regard to fermentative strains ，fermentation process ，process optimization and purification. To have a low cost advantage over the other chemical synthesizes ，the biological method needs to increase the concentration of 1,3-propanediol ，to strengthen the fermentation process that is more accurate and easier control. Economy and energy consumption need to be considered to integrate the whole process of fermentation and separation ，which should be the focus of research and industrial production of 1,3-propanediol by biological process in the future. Key words ：1,3-propanediol ；fermentation ；bioconversion ；glycerol1,3-丙二醇（1,3-PD ）是一种重要且用途广泛的化工原料，其与对苯二甲酸聚合合成的聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT ），是一种性质优良的聚酯材料。
第五章丙酮酸发酵过程优化 (1)第一节丙酮酸发酵概述 (1)一、引言 (1)二、国外研究水平和发展趋势 (1)三、发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题 (6)四、本章主要内容 (7)第二节营养条件对光滑球拟酵母WSH-IP12生产丙酮酸的影响 (8)一、引言 (8)二、酵母粉浓度对丙酮酸发酵的影响 (8)三、蛋白胨浓度对丙酮酸发酵的影响 (8)四、豆饼水解液和无机氮源对丙酮酸发酵的影响 (9)五、分批培养中供氧方式和培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响 (10)六、葡萄糖流加培养中氮的供给对丙酮酸发酵的影响 (11)七、讨论 (13)第三节维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 (15)一、引言 (15)二、突变株T. glabrata WSH-IP303的获得及其氮源同化能力 (15)三、维生素对WSH-IP303过量合成丙酮酸的影响 (17)四、维生素亚适量供给下的分批发酵过程 (20)五、讨论 (22)第四节丙酮酸分批发酵的供氧控制模式 (25)一、引言 (25)二、丙酮酸分批发酵过程的溶氧变化情况 (25)三、不同k L a下WSH-IP303发酵生产丙酮酸的动力学特征 (25)四、分阶段供氧控制模式的提出和实验验证 (27)五、讨论 (29)第五节丙酮酸发酵过程的代谢网络分析 (32)一、引言 (32)二、代谢网络构建和代谢通量计算 (32)三、不同硫胺素浓度和不同DOT下的分批发酵结果 (34)四、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADPH的产生与消耗 (37)五、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADH的产生与消耗 (38)六、不同硫胺素浓度和不同DOT下ATP的产生与消耗 (39)七、讨论 (41)第六节丙酮酸发酵的逐级放大和中间试验 (49)一、引言 (49)二、30 L发酵罐中葡萄糖浓度对WSH-IP303菌株生产丙酮酸的影响 (49)三、300 L规模的丙酮酸发酵试验 (50)四、5 m3规模丙酮酸发酵中试 (51)第五章丙酮酸发酵过程优化第一节丙酮酸发酵概述一、引言丙酮酸(Pyruvic acid)，又称2-氧代丙酸(2-oxopropanoic acid)、α-酮基丙酸(α-ketopropionic acid)或乙酰基甲酸(acetylformic acid)，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。
影响发酵过程的因素影响发酵过程的因素主要有以下几个方面。
温度温度对微生物的影响是多方面的。
首先，温度影响酶的活性。
在最适温度范围内，随着温度的升高，菌体生长和代谢加快，发酵反应的速率加快。
当超过最适温度范围以后，随着温度的升高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期缩短，产量降低。
温度也能影响生物合成的途径。
例如，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强，但当温度超过35℃时，则只合成四环素而不合成金霉素。
此外，温度还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收等。
因此，要保证正常的发酵过程，就需维持最适温度。
但菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同。
如灰色链霉菌的最适生长温度是37℃，但产生抗生素的最适温度是28 ℃。
通常，必须通过实验来确定不同菌种各发酵阶段的最适温度，采取分段控制。
pHpH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。
细胞膜的带电荷状况如果发生变化，膜的透性也会改变，从而有可能影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌。
此外，pH 还会影响培养基中营养物质的分解等。
因此，应控制发酵液的pH。
但不同菌种生长阶段和合成产物阶段的最适pH往往不同，需要分别加以控制。
在发酵过程中，随着菌体对营养物质的利用和代谢产物的积累，发酵液的pH必然会发生变化。
如当尿素被分解时，发酵液中的NH+4浓度就会上升，pH也随之上升。
在工业生产上，常采用在发酵液中添加维持pH的缓冲系统，或通过中间补加氨水、尿素、碳酸铵或碳酸钙来控制pH。
目前，国内已研制出检测发酵过程的pH电极，用于连续测定和记录pH 变化，并由pH控制器调节酸、碱的加入量。
溶解氧氧的供应对需氧发酵来说，是一个关键因素。
从葡萄糖氧化的需氧量来看，1 mol的葡萄糖彻底氧化分解，需6mol的氧；当糖用于合成代谢产物时，1 mol葡萄糖约需1.9mol的氧。
因此，好氧型微生物对氧的需要量是很大的，但在发酵过程中菌种只能利用发酵液中的溶解氧，然而氧很难溶于水。
丙丁梭菌/酿酒酵母混合培养同时外添乙酸的ABE发酵体系强化丙酮生物合成丙酮-丁醇-乙醇发酵(简称ABE发酵),其产品是丙酮(A)、丁醇(B)和乙醇(E)的溶剂混合物,摩尔比约为3:6:1。
丙酮和丁醇都是重要的平台化合物和高效液态燃料或添加剂。
目前,丙酮生产几乎全部依赖使用化石原料进行,ABE发酵的研究主流就是提高丁醇产量或提高丁醇占总溶剂的产品比例(丁醇/丙酮比),丙酮生物合成基本不受重视。
但是,ABE发酵的经济性和实用性依赖于将丙酮作为重要平台化合物和高效燃料进行评价,因此,强化丙酮生物合成可以作为改善ABE发酵性能的重要切入点。
本论文旨在维持丁醇浓度的同时,强化丙酮的生物合成、提高其发酵浓度,研究丙丁梭菌/酿酒酵母混合培养同时外添乙酸的发酵策略改善ABE发酵性能的理论机理和可行性。
主要研究内容和结论如下:(1)在ABE发酵产溶剂期、外添少量乙酸能降低丙酮丁醇梭菌胞内的NADH再生速度、使较多碳流走向不依存NADH 的丙酮合成途径;促进有益于细胞生存和丁醇合成的氨基酸在在梭菌胞内的积累。
丙酮浓度、丁醇浓度和丙酮/丁醇比分别达到7.34g·L-1、12.18 g·L-1和0.6。
与传统发酵(对照)相比,丙酮浓度和丙酮/丁醇比分别提高了25%和20%,丁醇浓度基本不变。
(2)研究了丙丁梭菌/酿酒酵母混合培养同时外添少量乙酸(4 g·L-broth-1)的ABE发酵体系改善ABE发酵性能的机制机理。
研究发现,该ABE发酵体系,强化了梭菌对葡萄糖的利用能力;可以将梭菌胞内的NADH再生速率控制在较为适中的低水平,缓解了细胞的能量周转负荷,在不影响丁醇合成的同时、使更多碳流走向丙酮合成途径;也可以增强有益氨基酸在梭菌胞内的积累、提高梭菌对高丁醇浓度环境的耐受力。
在7 L厌氧发酵罐中实施该发酵策略,最终丙酮和丁醇浓度可以同时达到8.27 g·L-1和13.91g·L-1的较高水平,比对照提高41%和20%。
一株拜氏梭菌利用甘蔗废糖蜜生产丙酮丁醇的研究1拜氏梭菌：未来丙酮丁醇的生产者拜氏梭菌（Bacillus subtilis）是一种强大的古种类微生物，因其功能多样、代谢稳定、耐受性强、发酵效率高而受到广泛关注。
近年来，各个研究院所对拜氏梭菌做了大量研究，着重研究它在生物能源、有机氢等几个领域的应用。
近期，一组国外研究人员重点研究了由拜氏梭菌以废弃甘蔗糖蜜作为起始物，利用无异核糖体糊精和木聚糖酶的联合合成，生产丙酮丁醇（PDC）的可能性。
2废弃甘蔗糖蜜：拜氏梭菌首次利用离餐废水生产PDC 废弃甘蔗糖蜜是芭蕉糖、木聚糖和果糖的混合物，含有丰富的糖分，是一种优质的起始物料，但其应用却被限制在少量的培养基及食品中。
研究团队利用其他研究所提供的离餐废水中的废弃甘蔗糖蜜，以拜氏梭菌为微生物发酵剂，并结合木聚糖聚合酶CatA，开展了一系列的实验。
实验中，拜氏梭菌在PCD酶活性增加的同时，也促进了植物活性微生物聚酶CatA的高级分解，有效提高了利用废弃甘蔗糖蜜生产PDC的效率（25g/LPDC）。
3潜在应用：拜氏梭菌可有效减少对活性材料的依赖结果表明，拜氏梭菌可以有效的利用废弃甘蔗糖蜜，从而生产PDC，并提高微生物种群多样性，开发出新型简单、清洁且高效的技术平台。
在纳利和高活性非纳利方面，拜氏梭菌很容易受到激活，可减少对一般特定外源活性物质依赖，为农业可持续发展提出新的建议。
另外，这一新型生物制造平台也能有效提高活性物质生产速度，为拜氏梭菌发酵生产PDC提供了机遇。
4结论：拜氏梭菌是古种类的实用微生物拜氏梭菌的应用不仅可以改善环境，还可以确保农业的可持续发展，以及发挥传统微生物的多功能性，建立古种类的实用微生物。
拜氏梭菌的应用可能会改变现有的生物制技术，在节约能源、减少污染、环保或安全等方面都能变得更加可行。
未来，拜氏梭菌有望成为丙酮丁醇的生产专家，为制造部门提供新的制造途径。
Ｉｉｊ：Ｉ｝ｌｊＩ５ｌ！ｌ ５圈。ｉ２；０ １ ５ Ｎ Ｏ—：．ｉ３ ４ 。。 。．。 。 ．。 。 ． ＤＯＩ：１０．１６６６０／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７４ ０９８Ｘ．２０１５．３４．１２０ 丙酮一丁醇的微生物发酵生产①
朱会芹王瑞飞 （河南师范大学生命科学学院河南新乡４５３００７）
工业技术
摘 要：在过去的一段历史时期内，丙酮＿丁醇发酵一度因生产成本高，产率低而发展迟缓。近年来，随着能源需求的改变及环 境保护的要求，其可再生、无污染的优点再次引起人们的关注。该文对丙酮—丁醇发酵过程中所需的可替代性原料、高产菌株选育 技术及相关发酵工艺等方面的最新进展进行了总结，并对这些方面进行了简单评述。 关键词：生物燃料 微生物发酵 可替代性原料 菌株选育 发酵工艺 中图分类号：Ｑ９３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４—０９８Ｘ（２０１５）Ｉ２（ａ）一Ｏｌ２０—０３
丙酮ｒ醇发酵历史悠久，早在ｌ９ｌ２年，人们开始利用梭 状芽孢杆菌发酵，即以粮食作物为原料 产内酮和丁醇…。 该产业一度成为世界上二第 人发酵产、 用于生产火药、合 成橡胶等重要的化学品。区到２０世纪中叶，廉价的石油被大 量开采平【ｌ利用，以 油为原料来合成化：［产品的方法快速 兴起，导致丙酮一丁醇发酵方法的利用越来越少，其发酵 艺的改进也严重迟滞。进入２１十Ｉ｝＝纪后，由＿丁：人类长时问的开 采，石化资源已接近耗竭；另外，由于－［艺水平和处理技术 的限制，大量含有 油类的废渣、废水排放引起 ｒ严重的环 境污染。为了贯彻经济与生态环境协凋发展的方针政策，寻 找绿色能源已经成为迫在眉睫之事。此时，丙酮一丁醇发酵 途径冉次引起人们的极大关注，微生物发酵制丙酮一丁醇较 原来丙酮一丁醇发酵的优点足发酵刷期短、产物转化率高、 代ｉ身寸剐产物少。 此即使Ｈ前微 物发酵产丙酮一＿丁醇成本 高，尚不具有很人的竞争市场，但是通过原料和技术的改进 后叮以降低 产成本、增加产量，ｒ醇将成为最具实用价值 的廉价、清浩的新型液态，卜物燃料。该文章对近年来改善丙 酮 醇发酵的相 方法和措施进行综述，以期对相关领域 的研究人员有所帮助。 １生产丙酮一丁醇的可替代性原料 目前，工、 生产内酮和丁醇＿丰要以农作物为原料，存在 蕾成本高，产量相对较低的问题。为ｒ解决这种问题，需要 寻找可替代原料。近年来发现的可替代原料丰要有木质纤 维素类、合成气、废弃蛋白质类。日前认为，木质纤维素类生 物质是Ｉ址界卜最丰富、最廉价的可再生能源，木质纤维素类 包括森林残留物 Ｉ农业残留物，都可用ａｃｅｔｏｎｅ ｂｕｔａｎｏｌ ｅｔｈａｎｏ］（ＡＢＥ）梭状芽孢杆菌发酵生产丙酮平¨ｒ醇， 是 刘‘ｒ不同的木质纤维素类原料，丙酮一丁醇的生产效率也／ｆ 尽相同。Ｓｗａｎａ等 用４种原料：柳枝稷、杨树、玉米秸秆、 小麦秸秆生产丁醇时发现，玉米秸秆是生产丁醇产量最高 的原料，其在生产丙酮和丁醇过程中最大利用率可达７５％。 依据当前情况看，玉米秸秆仍是纤维素类物质中用干牛产 丙酮和丁醇的首要选择。合成气是由ＣＯ、Ｈ 、ＣＯ 等组成的 混合气体，合成气发酵燃料是 种商业化的边缘技术，其低 成本的发酵媒介提高了发酵过程的可行性。例如，使用玉米 浆（ＣＳＬ）代替酵母提取物，发酵介质成本减少了２７％，乙醇 的产量较原来多出７８％。ＣＳＬ介质用下连续发酵时，产生乙 醇、正丙醇、ＩＥ丁醇的最大浓度分别是８ ｇ・Ｌ～、６ ｇ・ 、Ｉ ｇ・ “ 。随着人们生活水平的提升，动物垃圾和粪便越来越
微生物代谢途径调控下的丙酮酸发酵工艺优化与可持续发展目录1. 内容简述 (2)1.1 微生物代谢的基本概念 (2)1.2 丙酮酸及其在微生物代谢中的作用 (3)1.3 发酵工艺的重要性与现状 (4)1.4 本研究的目的和方法 (6)2. 微生物代谢途径的调控机制 (7)2.1 代谢途径的概述 (8)2.2 丙酮酸代谢的代谢关键是什么 (9)2.3 关键酶的调控作用 (11)2.4 影响丙酮酸代谢的外部因素 (12)2.5 细胞信号机制在调控中的作用 (13)3. 丙酮酸发酵工艺的基本原理 (14)3.1 发酵过程的概述 (15)3.2 发酵工艺的类型和控制方式 (16)3.3 丙酮酸在发酵工艺中的作用 (18)3.4 发酵过程的能量平衡和转化效率 (19)4. 影响丙酮酸发酵工艺优化的因素 (20)4.1 菌株的选择与优化 (21)4.2 营养成分和培养条件的优化 (22)4.3 环境条件的影响 (23)4.4 工艺操作和控制策略 (25)5. 丙酮酸发酵工艺的可持续发展策略 (26)5.1 生物量的最大化 (27)5.2 副产物优化利用 (29)5.3 废水处理与循环利用 (30)5.4 能源与材料的可持续性 (32)6. 案例研究 (33)6.1 案例背景 (35)6.2 案例分析 (35)6.3 实验方案与过程 (38)6.4 结果与讨论 (40)6.5 可行性与经济分析 (40)7. 结论与未来展望 (41)7.1 本研究的结论总结 (43)7.2 未来研究方向和挑战 (44)7.3 可持续发展在发酵工艺中的展望 (45)1. 内容简述本文献探讨微生物代谢途径调控在丙酮酸发酵工艺优化与可持续发展中的关键作用。
丙酮酸作为重要的生物基础化学品，其高效生产对实现生物产业的可持续发展具有重要意义。
文章首先综述了丙酮酸发酵工艺的基本原理和现状，针对目前存在的技术挑战和发展困境进行深入分析。
重点阐述了微生物代谢途径调控技术在丙酮酸发酵过程中的应用，包括基因工程、代谢组学、以及环境调控等策略，并深入探讨了其对丙酮酸产量、质量和生产成本的影响。
