微生物天然产物早期鉴别及去重复方法研究进展

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 微生物天然产物早期鉴别及去重复方法研究进展 作者：王开梅等 来源：《湖北农业科学》2013年第22期

摘要：微生物天然产物具有独特的结构多样性。随着研究的深入，研究者在进行天然产物筛选时遇到已知化合物的机会加大，有必要在研究的早期对粗提物中的化合物进行早期鉴别及去重复，以减少不必要的人力、物力及财力的浪费。文章对涉及天然产物早期鉴别及去重复的方法——薄层层析技术（TLC）、高效液相色谱（HPLC）-光谱联用技术及天然产物数据库在天然产物早期鉴别及去重复中的应用进行综述，以期为新药的研究与开发提供一些借鉴。

关键词：微生物天然产物；早期鉴别；去重复；薄层层析；液相色谱-光谱联用技术；数据库

中图分类号：TQ028.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5409-06 20世纪20年代弗莱明博士从青霉菌中发现青霉素揭开了有目的地利用微生物次生代谢产物的序幕。经过80多年的研究，目前已经报道的具有生物活性的微生物次生代谢产物达到了20 000个以上[1]。其中，一些具有重要的生物活性的微生物天然产物已被开发成为医药、农药[2-4]，如青霉素、头孢菌素、他汀类药物、环孢菌素A、阿维菌素、Strobilurin类杀菌剂等，在农药及医药中占据了相当大的比重。微生物天然产物成为新药开发的重要源泉。尽管跨国医药企业在20世纪90年代对天然产物研究与开发的兴趣曾经一度下降，但由于组合化学及高通量筛选并未为其带来预期的结果，这些企业对天然产物的研究已经在复苏，天然产物在新药的研究与开发中发挥着重要的作用[5-10]。

据估计，开发一种新药平均要花10～15年的时间，总费用已超过10亿美元[11]。在从微生物天然产物中进行药物筛选研究时，研究者经常会碰到已知的化合物或不感兴趣的化合物。为了避免不必要的人力、物力及财力的浪费，研究者应尽可能在研究的早期对微生物粗提物中的化合物进行初步鉴别，排除其中的已知化合物或重复的化合物。微生物天然产物早期鉴别及去重复的一般流程见图1。以往人们利用纸层析、薄层层析进行微生物天然产物的早期鉴别及去重复。目前，高效液相色谱（HPLC）已广泛应用于微生物天然产物的早期鉴别及去重复，与高效液相色谱技术联合使用的现代分析技术的发展，使微生物天然产物的早期鉴别及去重复更为方便。而天然产物数据库的建立，则大大简化了微生物天然产物的早期鉴别与去重复的过程。本研究对用于微生物天然产物的早期鉴别及去重复的方法进行总结，以期对微生物天然药物的研究与开发提供一点借鉴。

1 薄层层析 龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 微生物在次生代谢过程中产生复杂的次生代谢产物。这些复杂组分的物理化学性质不同，其在不同的溶剂系统中扩散的速度不同。用于微生物次生代谢产物分离的材料包括纸、硅胶、氧化铝等。事实上，从20世纪40年代开始纸层析技术就被用于微生物产生的化合物的早期鉴别与去重复。在20世纪80年代，Zahner等[12]根据不断增加的薄层层析（TLC）色谱及显色剂知识，提出了一个基于薄层层析的微生物天然产物的筛选策略——化学筛选。微生物提取物经薄层硅胶层析展开后，可在紫外及可见光下记录层析样品的层析情况；另外，利用多个显色剂对层析后的样品进行显色。通过与数据库中已知化合物进行对比，可初步确定样品中的化合物是否为数据库中的化合物。该方法在德国汉高研究所（HKI）和HOECHST制药公司得到运用，利用该方法对8 000株微生物进行了筛选，分离到259个化合物，其中129个化合物是新结构化合物。新化合物分离的比率达到50%[13]。云南大学微生物研究所李铭刚等[14，15]通过与HKI合作，利用其TLC数据库对一株嗜碱放线菌的次生代谢产物进行了早期鉴别，从中分离到了两个活性化合物。Filtenborg等[16，17]也采用TLC方法，结合可见光、紫外线及显色剂，对真菌产生的毒素进行了筛选。但是该方法的最大缺陷是分辨率不高、自动化水平不高，特别是对一些未知化合物缺乏有效的鉴别手段，对化合物的快速鉴别依赖于数据库中化合物的数量。

2 液相色谱（LC）技术与光谱技术联用 20世纪60年代末至70年代初，科克兰（Kirkland）等人开发了世界上第一台商业高效液相色谱仪，开启了HPLC时代[18]。随着技术的发展，如柱料的改进、高压泵的应用，HPLC技术的分离效果提高迅速，而与计算机联用则大大提升了高效液相色谱的自动化程度。LC技术已广泛应用于生物活性物质的分离、纯化。将具高分离性能的LC技术与能够获取丰富化学结构信息的光谱技术相结合，通过一次或少数几次分析即可全面地获得整个微生物粗提物的化学组成、含量及结构等信息，在研究的早期即鉴别或鉴定出化合物的结构及预测出新化合物的存在，达到对生物活性物质进行快速筛选的目的，大大促进了微生物来源的有生物活性的新化合物的发现。

2.1 与紫外光谱联用（LC-UV） 微生物粗提取物通过色谱柱分离后，含有某一特定化合物的流动相在通过光电二极管阵列检测器时，计算机的色谱工作站可获得这一化合物的紫外光谱图。色谱工作站可将获得的紫外图谱存储在计算机中，并可与建立的已知或标准化合物的紫外图谱库进行比对，快速确定该化合物是否为已知化合物。此外，紫外光谱还可提供一些被检测的化合物的结构信息。液相与紫外光谱技术的联用，已广泛应用于微生物天然产物的化学筛选，研究者利用这一手段结合生物活性筛选，从微生物中发现了一些新的生物活性化合物[19-31]。德国Goettingen大学的Laatsch教授研究小组建立了天然产物标样及分离的天然活性化合物的紫外图谱库，用于微生物天然产物的早期鉴别与排重。受到资源的制约，这种自建的数据库中化合物的数量相对较小。丹麦理工大学的研究者建立了自动比较LC所得到的化合物紫外图谱的方法，并利用此方法发现了两个新的化合物[32，33]。随着LC技术的发展，超高效液相色谱（UPLC）在微生物天然产物分析中的应用越来越广泛。利用UPLC与光电二极管阵列检测器联用，可更为迅速地龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 进行微生物粗提取物中化合物组成的分析[34]。光电二极管阵列检测器的缺点在于不能检测不具有发色基团的微生物天然产物。此外，由于可供分析的已知化合物的数量有限，采用此种方法能够剔除的仅为已有的化合物。

2.2 与质谱联用（LC-MS） 质谱仪具有灵敏度高的特点，通常可检测到纳克乃至皮克级的化合物，可获得被检测化合物的分子量与结构信息。高分辨质谱（MS）还可确定被分析的化合物的分子式。与LC联用的质谱仪包括：单四极杆、串联四极杆、离子阱及飞行时间质谱（高分辨）仪等。Fredenhagen等[35]建立了以LC-离子阱质谱仪联用来快速有效地鉴定微生物提取物中原来已分离鉴定的化合物的方法。采用LC-MS对微生物发酵提取物中的化合物进行分析，通过与该数据库中已知天然产物的母离子MS数据进行比较，基本上可以确定微生物发酵提取物中是否有新的化合物。Si等[36]采用LC/ESI-MS/MS对来源于藤黄灰链霉菌发酵液的次生代谢产物进行化学筛选，鉴定出了46种异戊他定系列氨基寡糖类成分，其中41种为新化合物。在该LC-MS分析结果的指导下分离得到了其中11个化合物的单体，经核磁共振（NMR）分析等手段确认了它们的结构，均与LC-MS提示的结构相一致。Feistner[37]采用液质联用对Erwinia属细菌的代谢物组成进行了分析。Nielson等[38]利用液相色谱-紫外与高分辨飞行时间质谱，建立了一个快速有效的鉴别真菌次生代谢产物及其分子组成的方法。Kim等[39]利用液质联用对4株Myxococcus xanthus的次生代谢产物进行了鉴别，从中发现了一个新化合物Myxalamid K。而利用超高效液相色谱-质谱联用，可以更加快速地对微生物提取物中的化合物进行鉴别。Berrue等[40]利用UPLC-MS建立了Erythropodium caribaeorum珊瑚的主要代谢产物的UPLC-MS数据库。利用UPLC-MS，他们从该珊瑚的附生微生物中快速筛选到了产生目标化合物的微生物菌株。Ito等[41]利用UPLC-MS对16 025个微生物提取物进行了分析，利用ACD IntelliXtract软件对得到的液质分析数据进行了处理，从提取物中发现了38 000多个不同的化合物峰。而将这些化合物的相关信息整合，形成了一个数据库[41]。德国的Goettingen大学建立了1 000多个微生物天然产物的ESI MS/MS数据库，用于化合物的早期鉴别[42]。还有的研究者利用电喷雾质谱仪直接进样，对微生物提取物的化合物组成进行分析[43-45]。

由于质谱仪本身的局限性，其所得到的结构信息不足以解决化合物的鉴定问题；另外，不同的化合物对离子化条件要求不同；与液相联用时对流动相的要求较高，不宜使用不挥发性缓冲盐。因此，单纯依赖LC-MS联用仍不能解决微生物天然产物的早期鉴别与去重复等问题。

2.3 与核磁共振谱联用（LC-NMR） NMR技术是用于结构鉴定的最为有效的手段。将NMR与LC结合起来，利用LC对化合物的高效分离，对目标化合物的结构进行鉴定。LC-NMR的操作模式有3种：连续流（Onflow）、停流（Stopped flow）及峰贮存（Loop-storage）[46，47]。NMR的灵敏度相对质谱来说较低，通常最低只能检测微克级的样品。但是随着技术的进步，在LC与NMR联用的硬件及软件方面取得了显著进展，如核磁共振仪的磁场强度达到900 A/m，专为联用设计的流通探头、毛细管探头、超低温探头等，可提升检测的灵敏度，在某些模式下可以检测微克以下