122精蛋白锌胰岛素注射液延缓作用检查法-中国药品检验标准操作规范2010年版
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精蛋白锌胰岛素注射液延缓作用检查法
家兔法
1 实验材料及用具
1.1 天平精度0.01mg或0.1mg 标准品称量用
精度1mg 试剂称量用
精度10g 家兔称重用
1.2 紫外分光光度计。
1.3 离心机。
1.4 恒温水浴。
1.5 pH计。
1.6 实验用具微量注射器、微量取液器、定量加样器、容量瓶、吸管、移液管、小试管、小烧杯、量筒、凝集盘、脱脂棉、滤纸。
1.7 试剂枸橼酸、枸橼酸三钠、氯化钠、无水葡萄糖、过氧化物酶（POD PZ>3）、葡萄糖氧化酶（GOD）、二甲基苯胺、4-氨基安替吡啉（4-AA）、三氯醋酸、盐酸。
2 溶液配制
2.1 0.1mol/L枸橼酸缓冲液（pH6.6）精密称取枸橼酸0.7350g，枸橼酸三钠1
3.620g，加水至500ml混匀。
pH范围应在5.4~7.0。
2.2 葡萄糖氧化酶试剂
2.2.1 POD溶液精密称取POD适量，用水溶解使成3mg/ml的溶液，置4~8℃保存备用。
2.2.2 取3mg/ml POD溶液0.2ml、GOD 120单位、4-AA 10mg、二甲基苯胺0.05ml混合，加枸橼酸缓冲液至200ml，置4~8℃保存备用，如显淡红色即不宜使用。
或用血糖测定试剂盒。
2.3 5%三氯醋酸溶液称取三氯醋酸5g，加水至100ml。
2.4 生理盐水称取氯化钠4.5g，加水近500ml，加苯酚1g，用3mol/L盐酸调节pH 至2.5后，补足水至500ml。
2.5 葡萄糖标准溶液
2.5.1 精密称取无水葡萄糖200mg，加煮沸放冷的水至20ml得10mg/ml溶液。
2.5.2 分别精密量取10mg/ml溶液1.5ml、1.0ml、0.5 ml、0.25 ml置50 ml容量瓶中，加水至刻度，混匀得30mg/100ml、20 mg/100ml、10 mg/100ml、5 mg/100ml溶液。
上述葡萄糖标准溶液置4~8℃保存备用，如出现浑浊长菌时，不得使用。
2.6 胰岛素标准品溶液
2.6.1 取胰岛素标准品，放置至室温。
2.6.2 割开标准品小管（注意勿使玻屑掉入），精密称量置小烧杯中。
2.6.3 将称得的毫克数，乘以标示单位数，得总单位数。
2.6.4 精密加入pH2.5生理盐水配成与供试品浓度相同的溶液。
2.7 供试品溶液使用原液，不稀释。
3 实验动物
健康无伤，体重2.0~3.0kg的家兔若干只，雌雄均可，雌者无孕，一笼一只，编号。
4 检查法
4.1 准备工作
4.1.1 家兔在实验前18~20h移去饲料，但仍给予饮水，然后均匀分为两组（每组6~8只），一组为胰岛素标准品组，一组为供试品组，两组间家兔的性别和体重的分配情况应尽
可能相同。
4.1.2 实验前将耳静脉取血处去毛，并擦拭干净，取血时可用灯照保温，使静脉充血。
实验过程中停止供水，并注意避免惊扰。
4.1.3 取与动物数相等数量的小试管编号，每只加入5%三氯醋酸溶液0.36ml ，另一套相等数量小试管编号备用。
4.2 正常家兔血样的采集
4.2.1 用针头刺破血管，立即用微量取液器，精密量取血液0.06ml ，按编号加入预先装有5%三氯醋酸小管中摇匀。
4.2.2 用脱脂棉压住刺破的针孔，止血。
4.3 给药
4.3.1 正常家兔采血后，立即分别在各兔相同部位用微量注射器精确皮下注射相同体积的标准品或供试品溶液，各只家兔给药要间隔一定时间并记时，一般剂量为每兔1.0~1.2U 。
4.3.2 动物给药后，放回笼中。
4.4 取血样
4.4.1 标准品组于注射后2h 及6h 再分别自各兔取血样，操作同（4.2.1、4.2.2）。
4.4.2 供试品组于注射后6h 及9h 再分别自各兔取血样，操作同（4.2.1、4.2.2）。
4.5 测血糖值
4.5.1 离心 将小试管放入离心机管架中，2500r/min 离心15min 后取出。
4.5.2 精密量取离心后的上清液0.20ml.，放置于相应编号的另一套小试管中。
4.5.3 另取小试管5支，编号，分别加入葡萄糖标准系列溶液0、5、10、20、30mg/100ml,各管0.2ml 。
4.5.4 将（4.5.2）及（4.5.3）各管分别准确加入葡萄糖氧化酶试剂2.0ml ，混匀。
4.5.5 小管同时放入37℃±0.5℃恒温水浴，保温30min 取出，放置至室温。
4.5.6 按分光光度法于550nm 波长处测定各管的吸收度。
测定血糖值可待全部实验结束后，将各次采的血样同时进行；亦可每次采血后立即进行，但每次测定必须同时做葡萄糖标准曲线。
血样如需放置较长时间应于4~8℃贮存。
5 实验结果计算
5.1 血糖值的计算
5.1.1 由葡萄糖标准曲线各浓度所测吸收度计算回归方程式Y =A +BX 中的A 、B 值。
5.1.2 通过回归方程式由各管吸收度计算血样相当的血糖值，以每100ml 血中所含葡萄糖的重量（mg ）表示。
5.1.3 各管血糖值乘以校正值（按本法取血0.06ml ，加入0.36ml 5%三氯醋酸中，稀释 7倍，即校正值为7）即为各兔的血糖值。
或将葡萄糖标准溶液与被测定血样同法处理，通过回归方程式计算血样中的血糖值，即为各兔的血糖值。
5.2 各次测定所得血糖值均不低于正常血糖值90%的家兔或实验中途死亡的家兔结果均作废，不参加计算，能参加计算的家兔，每组不得少于6只。
5.3 算出每兔在注射后的血糖值相当于该兔在注射前的正常血糖值的百分数（简称血糖百分数）。
C （血糖百分数）=A （注射后血糖值）B （注射前血糖值）
×100% 5.4 算出每一组内每一时间各兔血糖百分数的平均值。
C=c 1+c 2+……+c n n
6 结果判断
6.1 用于胰岛素标准品组的所有家兔，发生痉挛或实验中途死亡的动物数，不得超过1/5。
6.2 胰岛素标准品组于注射后2h的血糖百分数平均值应不高于65%，注射6h的血糖百分数平均值应不低于95%，否则均应调整剂量复试。
6.2.1 注射后2h血糖百分数平均值高于65%，说明所用剂量偏低，应增加剂量。
6.2.2 注射后6h血糖百分数平均值低于95%，说明所用剂量偏高，6h尚不能恢复，应减小剂量。
6.3 供试品组于注射后6或9h的血糖百分数平均值中较低的一值不得大于75%。
原始记录内容如下：
实验日期
动物来源性别体重
溶液配制
标准品溶液配制第次标准品单位/毫克
供试品溶液配制
结果标准品组家兔注射后2h血糖百分数
标准品组家兔注射后6h血糖百分数
供试品组家兔注射后2h血糖百分数
供试品组家兔注射后9h血糖百分数
结论
起草人：刘群丽柯若伦（中国药品生物制品检定所）
复核人：陈华陈涵芬（上海市食品药品检验所）。
