三引物法鉴定T

目的基因T载体克隆实验步骤目的基因T载体克隆实验步骤PCR产物的T载体克隆一. 重组质粒的构建：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

连接反应通常将两个不同大小的片断相连。

很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。

pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。

这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。

因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶二. 感受态制备原理细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。

三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。

第1篇一、实验目的本实验旨在通过基因工程技术，将外源基因导入番茄植株，实现特定性状的表达，并研究转基因番茄的生长发育、生理特性和抗病性等方面的变化。

二、实验材料1. 番茄植株：品种为“中蔬5号”。

2. 外源基因：目的基因（如抗病基因、抗虫基因等）。

3. 载体：pGEM-T载体。

4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶等。

5. 试剂：植物细胞培养试剂、抗生素等。

三、实验方法1. 目的基因的克隆（1）设计引物，针对目的基因进行PCR扩增。

（2）将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞。

（3）挑选阳性克隆，进行测序鉴定。

2. 番茄植株的转化（1）将目的基因与载体构建成重组质粒。

（2）采用农杆菌介导法将重组质粒导入番茄植株。

（3）筛选阳性植株，进行PCR和Southern blot检测。

3. 转基因植株的筛选与鉴定（1）采用PCR和Southern blot方法检测转基因植株。

（2）对转基因植株进行抗性筛选，如抗病、抗虫等。

4. 转基因植株的表型分析（1）观察转基因植株的生长发育、生理特性和抗病性等方面的变化。

（2）对转基因植株进行产量、品质等指标测定。

四、实验结果1. 目的基因的克隆成功克隆了目的基因，并进行了测序鉴定。

2. 番茄植株的转化成功将重组质粒导入番茄植株，获得了转基因植株。

3. 转基因植株的筛选与鉴定通过PCR和Southern blot检测，证实了转基因植株的存在。

4. 转基因植株的表型分析（1）转基因植株的生长发育与对照植株无明显差异。

（2）转基因植株在抗病性、抗虫性等方面表现出显著的优势。

（3）转基因植株的产量和品质与对照植株相当。

五、讨论与分析1. 本实验成功将目的基因导入番茄植株，并获得了转基因植株，为研究转基因番茄的性状表达提供了基础。

2. 转基因植株在抗病性、抗虫性等方面表现出显著的优势，表明基因工程技术在农业生产中具有广泛的应用前景。

3. 实验结果表明，转基因番茄的生长发育、生理特性和抗病性等方面与对照植株相当，说明转基因技术对番茄的性状影响较小。

收稿日期：2014-09-05基金项目：云南省教育厅科学研究基金重点项目( 2012Z066)资助作者简介：费希同，硕士研究生，从事林木遗传育种研究。

E-mail: 798657293@注：辛培尧为通讯作者。

E-mail: xpytgyx@ITS2序列在植物DNA 条形码鉴定中的应用(综述)费希同，巨苗苗，林 源，李 斌，李德龙，辛培尧（西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224）摘 要：DNA 条形码技术的迅速发展极大地推动了植物的鉴定工作，随着鉴定工作的不断进行和新序列的不断发现，利用ITS2序列进行鉴定已成为目前较为广泛使用的鉴定技术。

本文根据ITS2序列的特点和性质，介绍ITS2序列鉴定的一般过程，并分析其特点和存在问题，以期为植物鉴定方面的研究提供参考。

关键词：ITS2序列；植物鉴定；DNA 条形码；研究进展Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2014.04.017中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2014)04-0339-04Application and Research Progress of ITS2 Sequence in Plant IdentificationUsing DNA BarcodingFEI Xi-tong, JU Miao-miao, LIN Yuan, LI Bin, LI De-long, XIN Pei-yao(College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan China)Abstract: The rapid development of DNA barcoding technology has greatly promoted the work of plant identification. With the increase of identification work and newly discovered sequences, the technology of ITS2 sequence has become a widely used identification at present. In order to provide certain theoretical reference of plant identification, this study introduced the ITS2 sequence identification process and analyzed the characteristics and problems occurred in the process, based on the characteristics of ITS2 sequence.Key words: ITS2 sequence; plant identification; DNA barcoding; research progress通常情况下，人们通过植物形态以及总结的一些经验对植物进行鉴定分类，这种分类手段误差比较大，尤其是许多植物的外部形态极其相似，给鉴定工作带来较大困难。

农杆菌转化鉴定引言：农杆菌转化鉴定是一种常用的基因转化技术，被广泛应用于植物基因工程领域。

本文将从农杆菌转化的原理、操作步骤、鉴定方法以及应用前景等方面进行介绍。

一、农杆菌转化原理农杆菌转化是一种通过农杆菌（Agrobacterium）将外源基因转移到植物细胞中的技术。

农杆菌是一种土壤中常见的细菌，具有天然的基因传递机制。

具体而言，农杆菌通过一种称为T-DNA的群体转座子将外源基因插入到植物细胞的染色体中。

二、农杆菌转化操作步骤农杆菌转化的操作主要包括以下几个步骤：1. 构建转化载体：将外源基因插入到农杆菌的转化载体中，并在其中加入适当的选择标记基因。

2. 转化菌的培养：将构建好的转化载体导入到农杆菌中，并通过培养使其大量增殖。

3. 植物材料处理：将目标植物材料进行预处理，如组织培养、愈伤组织的诱导等，为后续的转化提供条件。

4. 植物细胞转化：将培养好的农杆菌与植物材料进行共培养，使农杆菌中的T-DNA转移到植物细胞中。

5. 选择转化植株：通过添加适当的筛选剂，筛选出含有外源基因的转化植株。

6. 验证转化效果：通过PCR、Southern blot等分子生物学技术鉴定转化植株中是否存在外源基因。

三、农杆菌转化鉴定方法农杆菌转化鉴定是为了确认转化植株中是否成功引入了外源基因。

常用的农杆菌转化鉴定方法包括以下几种：1. PCR鉴定：通过设计特异引物，进行PCR扩增，根据扩增产物的大小和序列，判断是否存在外源基因。

2. Southern blot鉴定：将转化植株的基因组DNA进行限制性酶切，然后通过Southern blot检测外源基因的特异序列。

3. 荧光显微镜观察：通过将外源基因与荧光标记基因结合，利用荧光显微镜观察植物组织中的荧光信号，以确认外源基因的存在。

4. RT-PCR鉴定：通过逆转录PCR技术，检测转化植株中外源基因的表达情况。

5. Western blot鉴定：通过Western blot技术检测转化植株中外源蛋白的表达情况。

茶叶通讯　第48卷　第2期Journal of Tea Communication Vol.48, No.2投稿平台：一株茶轮斑病病原菌的分离鉴定及致病力卢声洁1，赵兴丽2，罗林丽2，程宇豪1，张金峰3，李　帅3，周玉锋2*1. 贵州大学 茶学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省农业科学院 生物技术研究所，贵州 贵阳 550006；3. 贵州省农业科学院 茶叶研究所，贵州 贵阳 550006摘　要：为明确发生于贵州省湄潭县茶叶所茶树资源圃中的茶轮斑病病原，采用单孢分离法和离体接种法对病原菌进行分离和致病性测定，分别观察形态学特征及结合分子生物学技术以确定病原菌的种类。

结果表明，菌株ZYP04-5能够侵染茶树叶片，是茶轮斑病的致病菌；形态学特征结合病原菌的ITS 、β-tubulin 和 tef1基因分析结果确定引起茶轮斑病的病原菌为卵圆新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis ellipsospora ）。

研究结果可为该病菌引起的茶轮斑病的防控提供理论基础。

关键词：茶树；茶轮斑病；卵圆新拟盘多毛孢；致病性中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：1009-525X （2021）02-253-258Isolation, Identification of a Pathogen of Tea Gray Blight and ItsPathogenicityLU Shengjie 1，ZHAO Xingli 2，LUO Linli 2，CHENG Yuhao 1，ZHANG Jinfeng 3，LI Shuai 3，ZHOU Yufeng 2*1. Tea College, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2. Institute of biotechnology, Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang 550006, China; 3. Tea Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, ChinaAbstract ：In order to identify the pathogen of tea gray blight that occurred in the tea resource nursery of Tea Research Institute in Meitan County, Guizhou Province. The single spore isolation method and in vitro inoculation method were used to isolate the pathogen and determine its pathogenicity. Morphological characteristics and combination of molecular biological technology were observed to determine the species of pathogen. The results showed that the strain ZYP04-5 could infect the leaves of tea plants, and it was the pathogen of tea gray blight; The morphological characteristics combined with analysis results of the pathogens of ITS, β-tubulin and tef1 genes to determine the pathogen causing tea gray blight was Neopestalotiopsis ellipsospora . The research can provides a theoretical basis for the prevention and control of tea gray blight caused by this pathogen.Key words ：Tea plant, Tea gray blight disease, Neopestalotiopsis ellipsospora , Pathogenicity收稿日期：2020-10-10 修订日期：2021-04-14基金项目：国家现代农业（茶叶）产业技术体系建设专项（CARS-19），黔科合平台人才（[2017] 5717号）作者简介：卢声洁（1995-），女，贵州兴义人，在读硕士研究生，研究方向：茶树病害防控。

前言:一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。

因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。

这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction)--聚合酶链式反应具有的特色之一。

这也是分子生物医学令人震撼的一例。

何谓PCR简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内(In Vitro) 的大量合成。

基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。

PCR的要素基本的PCR须具备１.要被复制的DNA模板(Template) ２.界定复制范围两端的引物(Primers). ３.DNA聚合酶(Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。

PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。

所谓Denaturing乃是将DNA加热变性，将双股的DNA 加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。

最后在DNA聚合酶(e.g. Taq-polymerase) 的作用下进行引物的延长(Extension of primers)及另一股的合成。

PCR的历史PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。

DNA合成酵素最早于1955年发现(DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。

现今所使用的酵素(简称Taq polymerase), 则是于1976年从热泉Hot spring中的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来的。

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程.本标准适用于未知细菌的快速种属分析,以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。

2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法。

细菌rRNA（核糖体RNA)按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。

16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。

16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右,既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

在16S rRNA分子中,可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息,所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。

针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序,得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性,通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。

3.设备和材料1.1器材移液器(1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000;基因分析仪:AB3500、AB31301.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶,10×Taq Buffer （Mg2+），dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator,5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；1.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管:1.5mL、200μL;Micro Amp TM Optical 96—Well Reaction Plate;Micro Amp TM Optical Adhesive Film；1.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F 5’—AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG—3'500 bp左右反向引物519R 5’- GWA TTA CCG CGG CKG CTG —3’第2部分正向引物357F 5'—CTC CTA CGG GAG GCA GCA G—3’750bp左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC—3’第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG —3’560 bp 左右反向引物1492R5'—TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T —3’其中M=C:A ， Y=C ：T 。