生物物质分离工程实验(10级版本)

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生物物质分离工程实验

实验须知：

1、认真预习理解每个实验的目的、原理、操作关键步骤和注意事项。

2、按时上课，迟到20分钟以上者建议重做实验；上实验课时须带实验指导、记录本和笔等。

3、分组后应固定，不能随意更换，不大声喧闹，遵守实验室规则。

4、实验前由教师讲解实验原理、实验具体操作方法以及如何写实验报告。

5、每次实验结束，每组的实验用具要清洗，并却待老师检查实验结果后，方能离开实验室。

6、学生每次实验要写出规范实验报告，报告数据必须如实记录。

7、教师根据实验操作情况、打扫卫生情况、实验报告及最后考核给出成绩（总分100份）。

（说明：生物工程专业本课程实验总学时为32个，因此安排11个实验

生物技术专业本课程实验总学时为16个，因此安排6个实验，做前6个实验）

2012年2月

2 实验一 有机溶剂萃取法中pH对表观分配系数的影响（第一次实验）

一、实验目的和要求

1.通过实验，加深对表观分配系数的理解并掌握其测定方法。

22.以红霉素为实验对象，了解pH在萃取工艺中的重要性。

二、实验原理

1.红霉素为大环内酯类抗生素，呈弱碱性，在不同pH条件下，在水溶液和有机溶液中溶解度不同，故能达到不同程度的分配。

表观分配系数是指在一定温度和压力下，当分配达到平衡时溶质在萃取相和萃余相中总浓度之比，可通过实验方法测定。对于弱电解质，溶液的pH对表观分配系数影响很大。一元弱碱性物质溶液pH对表观分配系数K的关系式见式（1-6-4）

pHpKKK1010

式中：K0——热力学分配系数，在一定的温度和压力下是常数

pk——化合物电离平衡常数的负对数

由上式可知，随溶液pH升高，K值增大，有利于红霉素萃取到有机溶剂中。反之，K值减小，可将红霉素从有机相反萃取到水相。

2.利用红霉素在冰醋酸中被浓盐酸水解后，与对二甲氨基苯甲醛形成有色物质，并在486nm波长处有最大吸收值的特性，可测定其化学效价，从而计算出表现分配系数。

三、实验器材与试剂

（一）器材

精密电子天平，60ml分液漏斗，分光光度计，恒温水浴锅，pH酸度计，移液管，烧杯，量筒，试管，50ml容量瓶，称量瓶和温度计等。

（二）试剂

红霉素成品，乙酸丁酯或乙酸乙酯，氯化铵，氨水，95%乙醇，冰醋酸，浓盐酸，对二甲氨基苯甲醛等。

四、操作方法

（一）溶液配制

1.pH9.0氯化铵缓冲液：称取NH4Cl固体70g，溶于蒸馏水中，加浓氨水48ml，再用蒸馏水稀释至1L。

2.红霉素原液：

A液：称取红霉素成品25mg于小烧杯中，加入2ml95%乙醇，溶解后，用去离子水稀释并定容至50ml。测pH值（用pH酸度计或精密pH试纸）。

B液：称取红霉素成品25mg于小烧杯中，加入2ml95%乙醇，溶解后，用pH9.0氯化铵缓冲液稀释并定容至50ml。测pH值（用pH酸度计或精密pH试纸）。

3.显色剂：取对二甲氨基苯甲醛适量，加冰醋酸溶解使成0.5%（W/V）的溶液。

4. 红霉素标准溶液：精密称取红霉素标准品适量，加95%乙醇溶解，制成0.2mg/ml的溶液。

5.盐酸-冰醋酸混合液：盐酸、冰醋酸按体积比为2：1的比例配成。

（二）萃取法测定表观分配系数

1.将上述已配制好的红霉素A液和B液各吸取15ml于2只分液漏斗中，再分别加入15ml乙酸丁酯或乙酸乙酯，振摇10min。

2.静置片刻，使其分层，放出下层水相（萃余液），用pH酸度计或精密pH试纸分别测定其pH，并测定操作温度。

3.用下述方法测定原液A和B以及2只分液漏斗下相液（萃余液）的化学效价。

3 4.用下式计算不同pH的表观分配系数：

萃余液效价萃余液效价原液效价k

（三）红霉素的化学效价测定方法

1.标准曲线的绘制：

在移液管中分别吸取红霉素标准溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5ml分别置于试管中，加冰醋酸4.0ml，显色剂1.0ml，再加盐酸-冰醋酸混合液至总体积为10ml，摇匀，置30℃水浴锅中保温10min（温度时间要准确，颜色为红色），取出，冷却后在486nm波长下比色，用其余的试剂作为空白比照。以吸光度值（A）为纵坐标，吸取的样品量（mg）为横坐标作图，并线性回归。

2.原液效价和萃余液效价的测定

（1）取红霉素A、B原液各0.5ml，置于试管中，按标准曲线的操作方法，比色后根据标准曲线计算原液效价。

（2）另取溶剂萃取系统中的二个萃余相若干ml，同上操作，比色后根据标准曲线计算原液效价。参考值A萃余相取1.5-2.0ml，B萃余相取3ml左右。

2.测定A、B两种萃取系统中萃余液的pH.（如果pH计不稳定，改为精密的pH试纸）

五、结果分析与讨论（试验报告上要预留空间，等理论课学过后再补上）

1.计算不同平衡pH时的表观分配系数K和红霉素的真分配系数K0.

2.根据红霉素的理化性质，分析pH影响其表观分配系数K值的原因。

实验二 双水相萃取系统的相图制作（第一次实验）

一、实验目的和要求

掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识。

二、实验原理

两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，相图是研究双相萃取的基础。相图是一条双节线，当成相组分的配比取在曲线下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。

三、实验试剂和器材：

（NH4）2 SO4溶液、PEG400、蒸馏水、漩涡振荡器（或大试管）、微量滴管装置（或带刻度滴管，滴定记录滴数，换算成体积）、电子天平、微量注射器、大试管、移液管等

四、实验步骤

1、 精确配置43.00％（g/ml）的（NH4）2 SO4溶液，测定其密度为1.172 g/ml。

2、 精确称取PEG400液体0.700g加入干燥的试管中，按表格第1号数据，用移液管加入0.5ml蒸馏水（水的密度按1g/ml计算），再缓慢滴加已配制好的（NH4）2 SO4溶液，并不断在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现混浊为止（呈雾状，不是沉淀），记录（NH4）2 SO4溶液的加入量（ml），并根据密度值求出重量（g）。（注意要缓慢滴加，不要滴过，否则又要重新称量）

4 3、 然后，按下表的第2号数据加水，使其澄清，继续向试管滴加，使其再次达到混浊，如此按下表3、4······反复操作。

4、 计算每次达到混浊时PEG在系统总量中的百分含量（％），以PEG的重量百分比浓度为纵坐标，以（NH4）2 SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。

（按下表数据加入、记录和计算）

序

数 加水量（g） 加（NH4）2 SO4溶液的量（记录滴数，按0.04~0.05ml/滴换算）（ml） 纯（NH4）2 SO4的累计量（g） 溶液累计总量（水＋硫酸铵＋PEG） （g） PEG的重量百分比浓度％ （NH4）2

SO4

的重量百分比浓度％

1 0.5

2 0.1

3 0.1

4 0.1

5 0.1

6 0.1

7 0.1

8 0.1

（一般到第5次以后就较难观察，少数组可滴至第8次，但至少要加5次）

五、结果分析与讨论

简述相图的特点和作用？

实验三 双水相萃取系统中高聚物和盐对相体积比的影响

（第二次实验）

一、实验目的和要求

1、 了解双水相系统形成的机理及常用的双水相系统。

2、 掌握双水相系统中相比的测定方法。

3、 巩固离心机的操作方法及注意事项。

二、实验原理

双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成,与一般分离纯化技术相比,双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点，在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。

常用的双水相系统有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。分成两相后，上下相体积比称为相比，相比增加，上相和下相相对组成的差别就增大，这将会极大地影响产物如酶在两相中的分配系数，使酶富集于上相。

5 三、实验试剂和器材：

（NH4）2 SO4固体、PEG400液体、PEG4000固体、糖化酶滤液（浓度为5%~10%均可）、

蒸馏水、带刻度离心管、电子天平（或台秤）、台式离心机等

四、实验步骤：

1、在四只10ml刻度离心管中，用电子天平准确称取以下药品到每个离心管中。

（1） （NH4）2 SO4固体1.30g， PEG400液体2.00g

（2） （NH4）2 SO4固体1.30g， PEG4000固体2.00g

（3） （NH4）2 SO4固体1.50g，PEG400液体1.80g

（4） （NH4）2 SO4固体1.10g， PEG4000固体2.20g

先把PEG4000固体称好后碾碎再加到离心管中，这样比较好溶解。

2、然后再用移液管分别在上述四只试管中各加入糖化酶上清液0.5ml，然后加水，直到总量为8.00g。

3、旋紧试管口，用力振摇数分钟，使（NH4）2 SO4或PEG4000固体完全溶解，并使两相充分混合，以使酶在两相中的分配达到平衡。

4、用台式离心机3000转/分钟离心分离10 min后，应观察到明显两相。（注意离心前对角线上的离心管一定要先平衡，若不平衡，可在套管中滴加少量水；再者，离心机转速在启动前打到零挡，启动后再慢慢加速到3000转/分钟，离心机停止转动前不能打开离心机的盖子）。

5、分别读出上、下相体积，并求出四个相体积比R值（即R1、R2、R3、R4）。四只离心管的上下相糖化酶的含量的测定，由实验四、五来完成。

五、结果分析与讨论

1、简述双水相系统的主要应用？

2、相比对分配系数有何影响？

实验四 双水相萃取系统中相体积比对蛋白质分配系数的影响（第二次实验）

一、实验目的和要求：

1、 掌握蛋白质在双水相系统中分配系数的测定方法。

2、 了解蛋白质与考马斯亮蓝的显色反应原理及应用。

3、 进一步巩固可见分光光度计的操作及制作标准曲线。

二、实验原理：

双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。利用生物物质在两相中不同的分配，可以实现它们的分离；生物大分子在双水相中上相和下相的浓度比被定义为分配系数（K=Ct/Cb）；分配行为受聚合物分子大小、成相浓度、PH、无机盐种类等因素