硫酸苯酚法测定总糖原理与步骤

苯酚硫酸法测定粗糖含量

1.原理：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

2.试剂：1.浓硫酸：分析纯，95.5%

2. 5%苯酚：取苯酚5g，定容至100ml。（每次测定均需现配）

3. 标准葡聚糖：分析纯葡萄糖。

3.绘制葡萄糖标准曲线：

标准曲线溶液的配制。准确称量50mg干燥至恒重的葡萄糖，加适量水溶解，转移至500mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，配成浓度为10ug/mL的葡萄糖溶液。然后按下表依次添加标准葡萄糖液、蒸馏水、5%苯酚溶液、浓硫酸，充分摇匀，沸水浴中30min，冷却后于490nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，求出回归方程。

试剂 试管号

1 2 3 4 5 6 7

标准葡萄糖溶液ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

蒸馏水ml 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

5%苯酚溶液ml 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6

浓硫酸ml 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0

葡萄糖浓度0 10 20 30 40 50 60 （ug/mL）

4.测定：

取样品糖用水溶解稀释成浓度为10~50ug/mL，沸水浴中30min，冷却后于490nm处测定吸光度，得其吸光值A,根据回归方程计算出样品中粗糖的浓度，进而计算出粗糖含量。

5.计算粗糖得率

硫酸苯酚法与硫酸蒽酮法测多糖要点介绍

硫酸苯酚法与硫酸蒽酮法测多糖

植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。

（一）苯酚法测定可溶性糖

【实验原理】

植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

【实验仪器及试剂】

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。

2．试剂：

（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。

（2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。

（3）浓硫酸（比重1.84）。

（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。

（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。

【实验步骤】 1．标准曲线的制作：取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5－20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

2．可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL

简介

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

原理

多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

试剂

1． 浓硫酸：分析纯，95.5%

2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

4． 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

8． 6mol/L 盐酸

操作

1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2．样品含量测定：

①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。

②离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。）

一、硫酸苯酚法测多糖含量之相礼和热创作

1、试剂配制

1.浓硫酸：分析纯，95.5%

2. 5%苯酚：取苯酚5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用.

3.尺度葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖.精确称取20m g经105℃干燥至恒重的葡萄糖尺度品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容.

2、制造尺度曲线

精确称取尺度葡聚糖（或葡萄糖）10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别汲取0.2、0.3、0.4、、、、及ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入5%苯酚1ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min当前于490nm测光密度，以1.0ml水按异样显色操纵为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得尺度曲线.

1 2 3 4 5 6 7 8

0

尺度葡萄糖溶液（mL） 0

蒸馏水（mL）

5%苯酚（mL） 浓硫酸（mL）

3 留意事项

（1）此法简单、快速、灵敏、反复性好，对每种糖仅制造一条尺度曲线，颜色持久.

（2）制造尺度线宜用相应的尺度多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数.

（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成等到次要组分单糖的尺度曲线的校正系数加以校正计算

（4）测定时根据光密度值确定取样的量.光密度值最好在0.1——0.3之间.比方：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定.

（5）正常的反应溶液是深棕色.糖越多颜色越深.留意硫酸的纯度.空白的颜色很深，阐明你的空白中的苯酚被氧化了深红是醌（苯酚氧化生成）的颜色颜色过深的话阐明你的酚的难度过大，一样平常是5%但是没遇到你说的那么严重，不是深红色的做的好的时分颜色很浅，颜色深点也有肯能.

操纵的时分有几条你必要留意的，这些对你的检测结果影响极大1、苯酚必要重蒸，配制的苯酚溶液必要妥善保管.2、样品检测的时分，向样品中加了苯酚溶液必要迅速摇匀，加入硫酸基本操纵：硫酸沿壁加，最好能旋转比色管，让硫酸能均匀的沿壁流下.3、加完硫酸必要马上摇匀，前提是塞子要配套，不怕烫热、冷水浴，要精确.