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基于微通道传感器与神经网络的牛奶体细胞数定量检测方法研究

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2018年第1期（总第252期） 试验研究

基于微通道传感器与神经网络的牛奶体细胞数定量检测方法研究 试验研究

张学超①① 崔传金①* 张晓晨① （①铜仁学院大数据学院 贵州 铜仁 554300 ①华北理工大

学 唐山市先进测试与控制技术重点实验室 河北 唐山）

摘要 为研究特定在线检测温度下，牛奶体细胞数与电导率和电容值双电参数之间的关系，本试验以随机采集的新

鲜牛奶为研究对象，使用培养的K562细胞配置不同细胞含量的奶样，并将其注入微通道传感器中，再使用GAMRY 600

电化学工作站测取不同细胞含量奶样的电导率和电容值，最后建立以电导率和电容值为模型输入，体细胞数为输出的神

经网络模型。结果表明：两种型号的微通道传感器在该检测模型下对N(阴性)、T(可疑)级奶样的检出率只有86.67%和86.67%、46.67%和60%；而对1(隐性)、2(较严重)、3(严重)级奶样的检出率均为100%。说明在该模型下，微通道传感器

的检测限可达到40万个/ml，模型输出值与实际值呈极显著线性关系。

关键词 牛奶 体细胞 电参数 微通道传感器 神经网络

中图分类号：S823.9+1 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2018)01-0001-03

奶牛乳腺炎(Cow Mastitis)是奶牛所有疾病中发病率

最高，危害最严重的一种疾病，美国每年因奶牛乳腺炎

疾病造成的经济损失高达20.00亿美元[1-2]。2016年全球原

料奶产量高达8.17亿t，中国原料奶产量仅3570万t，奶牛

单产仅8.3t，同年进口乳制品折合生鲜乳约1200万t[3]。同

期，美国牛奶总产量为9471万t，奶牛单产高达10.27t，但

生鲜乳价格却仅为3.2元/kg，我国均价高达4.05元/kg[4]。

此外，我国人均乳品消费量仅为世界平均水平的1/3[5]，

说明我国乳品市场还有巨大增长空间。Litwinczuk等[6]研

究表明，原奶中的体细胞数(Somatic Cell Count，SCC)与

日产奶量呈显著负相关(P<0.05)，平均SCC每提高1个水

平，日产奶量下降0.13kg。金亚东[7]等研究表明，SCC与

日产奶量呈极显著负相关(P<0.01)，平均SCC水平每升高1

个单位，日产奶量下降约1.3kg。因此，按照CMT检测标

准，若能尽早检测出奶牛(隐性)乳腺炎疾病，理论上奶牛

日单产约增4.48kg。由此可见，若要改变我国乳品市场的

竞争格局，关键要提高奶牛单产和原奶品质，而原奶中

体细胞数与奶牛乳腺炎患病等级、牛奶产量和品质密切

相关[8, 9]；2016年中国农垦乳业联盟发布《中国农垦生鲜

乳生产和质量标准》，新增体细胞数检测指标，规定40万

个/ml以下为合格乳[10]。因此，迫切需要研发能够在线检

测奶牛乳腺炎患病等级、牛奶产量和品质的新型传感

器。在体细胞数的所有检测方法中，电检测法具有方便

快捷、检测成本低和实时在线检测等优点，应用前景广

阔[11]。然而，体细胞数与电导率[12]和电容[13]有一定相关

关系；温度对测量电容参数也有重要影响[14]。在特定温

度条件下，试验通过微通道传感器测取不同细胞含量的

新鲜奶样电导率和电容值，并用低频区域的电导率和电

容值建立预测体细胞含量的神经网络模型，最终达到准确、快速、在线诊断奶牛乳腺炎和评判原奶产量和品质

的目的。 1 材料与方法

1.1 材料

美国GAMRY 600电化学工作站；美国HERA CELL 150i二氧化碳培养箱；日本OLYMPUS CKX301倒置显微

镜；日本OLYMPUS CX21生物光学显微镜；北京科伟永

兴79-1磁力加热搅拌器；上海舜宇DC-0515低温恒温槽；

上海GI208离心机；BCD-219SKDE冷藏柜；真空泵；高

精度温度计等，主要数据分析处理采用MATLAB R2012b

软件。 1.2 方法

1.2.1 奶样采集 奶样采自100多头同一品种的荷斯坦奶

牛。在奶样采集过程中，需要将分娩后1个月内的奶牛和

泌乳后期的奶牛除去[13]。采样时先用温开水擦拭乳头，

然后用75%的乙醇对乳头进行消毒，并用干净的医用棉签

擦干，且弃去前2次挤出的牛奶，再进行奶样采集。每个

乳区的牛奶分别挤入50ml干净的带有编号的玻璃瓶内密

封，在运输的过程中放入装有冰袋的隔热泡沫塑料盒内

进行保鲜。最后将当天采集的奶样带回实验室测试，来

不及立刻测试的奶样需在4℃条件下冷藏保存，防止牛奶

变质而影响测试效果。 1.2.2 测试奶样配制 （1）原奶中细胞含量的检验采用

改进的显微镜直接计数法，即碘酊染液染色，细胞计数

板计数。将奶样带回实验室后，将装有奶样的奶样瓶放

入低温恒温槽中，在40℃的恒温条件下恒温15min后取出[15]，再用磁力加热搅拌器搅拌3min，使得奶样中的体细

胞、脂肪滴等物质均匀分散，便于体细胞过滤和防止脂

肪滴等物质因凝聚而堵塞滤膜。最后用真空泵对预处理

1基金项目：贵州省铜仁学院院士工作站武陵山片区生态农业大数据研究与应用分站项目(黔科合平台人才[2016]5611)；贵州省教育厅创新人才团队项目(黔教合人才团队字[2015]67号)。 *通讯作者 山东畜牧兽医 2018年第39卷

的奶样进行负压过滤，得到无细胞含量的奶样；同时配

置碘酊染液，进行生物光学显微镜细胞计数，观测结果

如图1所示。（2）为解决特定乳腺炎患病等级体细胞含量

的奶样采集困难问题，试验中使用具有相似细胞结构功

能的K562细胞替代奶样中的体细胞。为此，将K562细胞

在二氧化碳培养箱中进行培养，培养结果如图2所示。

（3）将培养后的K562细胞与过滤后的奶样进行细胞含量配置，分别配置为0、10、20、40、80、160、320、640

万/ml的待测奶样，同时将配置好的不同浓度梯度的奶样

进行镜检计数，以便验证奶样配置的准确性。（4）试验

中，同一奶样重复镜检计数5次，取其平均值作为牛奶体

细胞最终含量。共测取120份奶样，并根据加利福尼亚CMT标准[14]，将奶样划分为5个等级，见表1。

图1 过滤后无细胞奶样 图2 培养后的K562细胞

表1 CMT法检测奶牛乳腺炎的标准 (万个/ml) CMT等级 N T 1 2 3 体细胞含量 0~20 20~4040~120 120~500>500 奶牛得病情况 健康(阴性) 可疑 隐性乳腺炎 较严重感染严重感染1.2.3 牛奶电容和电导率测量 因为温度对测量牛奶电

容有影响较大[14]，同时考虑在线检测和正常情况奶牛体

温两因素，确定38.6℃为试验测试温度。因此，将装有测

试奶样的微通道传感器(预热30min，以保证热传递达到平

衡)置于38.6℃的低温恒温槽中进行测试，同时使用高精

度温度计验证低温恒温槽中的水温是否符与测试温度一

致。最后使用GAMRY 600电化学

工作站测量在

10Hz~1MHz频率范围内的电阻和电抗值，并根据微通道

传感器的具体结构参数转换成对应的电导率和电容值。

同时，为了避免测试奶样之间相互交叉污染，每测试完1

个奶样后，注射器和微通道传感器都必须用超纯水清洗

干净，并用下一个测试奶样冲洗3次，再进行测试。所有

奶样均在采集后的12h内测试完毕。 2 结果

2.1 微通道传感器的设计

（1）微通道传感器电极采用99.99%的高纯度金，并

溅射到玻璃基片上；同时微通道管体选用透明、绝缘性

好的聚二甲基硅氧烷

(PDMS)，并用氧等离子技术进行处

理，以最大限度减少在通道内部产生气泡，同时也有助

于基片与盖片的永久封和[16]。微通道传感器由北京博奥

生物技术有限公司代工。（2

）为突出传感器的容抗作用

和降低感抗干扰，根据公式Xc=1/(ωc)=1/(2πfc)。式中：Xc为容抗，c为电容，ω为电极两端激励源信号角频率，f

为激励源信号频率。在激励源信号频率一定的情况下，

要想得到较高的容抗，只能减小测试电极的电容，又根据c=ξ0ξrA/L。式中：ξ0为绝对电容率，ξr为相对电容率，A为电极的横截面积，L为电极间距离。正是基于减小电

极横截面积和增加传感器长度2种方式来增加容抗；同时

考虑到方便进样和进一步减小界面电容等因素。因此，

设计了如图3所示的微通道传感器，具体参数见表2。

图3a 微通道传感器实物图

图3b 微通道传感器微观尺寸图

表2 微通道传感器参数 电极尺寸 微通道长 微通道宽 微通道厚 30μm 12mm 0.1mm 0.1mm 30μm 48mm 0.1mm 0.1mm 2.2 基于电导率和电容的细胞含量神经网络模型

（1）将奶样电导率和电容值2个向量作为BP神经网

络[17]输入，输入层神经元数为2。网络输出向量为体细胞

数，输出神经元数为1。该网络采用2个隐层，2个隐层之

间传递函数为Tansig，输出层函数为Purelin，训练函数为Trainlm。在网络训练前，将数据用Mapstd标准化函数进

行标准化预处理，以避免数据饱和并加速网络的收敛速

度。（2）通过调整隐层的节点数和相关的训练参数对网

络结构进行优化试验。经过多次的训练仿真发现，当最

大迭代次数为1000，误差性能目标值为0.0001。网络模型

的2个隐层神经元数为4和2时，结果较为满意，模型结构

为2-4-2-1，见图4。

图4 网络模型结构 3 讨论

3.1 传感器模型 （1）传感器模型分析(长12mm)。

2 2018年第1期（总第252期） 试验研究

0100200300400500600700-1000100200300400500600700

实实实 万万/ml网网网网实 万万/ml建模数据模型, R=0.99995

y = 0.9997*x + 0.12596R2

=0.9999

0100200300400500600700-1000100200300400500600700

实实实 万万/ml网网网网实 万万/ml预测数据模型, R=0.99996

y = 1.0017*x - 0.28721R2=0.99992

图5 建模数据模型线性回归曲线 图6 预测数据模型线性回归曲线 （2）传感器模型分析(长48mm)。

0100200300400500600700-1000100200300400500600700

实实实 万万/ml网网网网实 万万/ml建模数据模型, R=0.99537

y = 0.99076*x + 1.489R2=0.99076

0100200300400500600700-1000100200300400500600700

实实实 万万/ml网网网网实 万万/ml预测数据模型, R=0.99652

y = 0.9902*x + 4.3618R2=0.99305

图7 建模数据模型线性回归曲线 图8 预测数据模型线性回归曲线 （3）表3、表4分别为传感器的模型评价参数和各级

正确检出率。 表3 模型评价参数 模型参数 传感器(12mm) 传感器(48mm)相关系数(R) 0.99995 0.99537 模型均方根误差(RMSE) 2.06739944 20.2285328 预测集的预测相关系数(Rp) 0.99996 0.99652 预测均方根误差(RMSEp) 1.94165127 18.428302

表4 各级正确检出率 (%) 患病等级 N T 1 2 3 预测总体奶样总数 45 15 15 30 15 14 120模型正确检出率(12mm) 86.67 46.67100 100 100 85.7188.33模型正确检出率(48mm) 86.67 60 100 100 100 85.7190 3.2 模型处理结果分析

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乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立

乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立

乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立

盖冬雪;任洪林;卢士英;胡盼;孟宪梅;刘熙;宋德刚;金雯;张嵩

【摘 要】本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法.优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理方案.结果表明,qPCR检测可特异性扩增大肠杆菌,1×108

CFU/mL的大肠杆菌经90℃水浴30 s全部致死后,采用10 μg/mL的PMA暗孵育15 min后冰上曝光10 min为最佳处理方案,这种处理方案可最大程度抑制死细胞信号,而对活细胞几乎没有影响,样品中微生物初始浓度不低于1×108 CFU/mL时较稳定,得到标准曲线回归方程y=-3.356x+47.413,R2=0.9989,最低检测限为103 CFU/mL,加标样本检测结果与实际相符.该方法为利用PMA-qPCR检测食品中的活大肠杆菌杆菌奠定了基础.

【期刊名称】《中国畜牧兽医》

【年(卷),期】2016(043)002

【总页数】6页(P493-498)

【关键词】大肠杆菌;叠氮溴化丙啶;qPCR;计数

【作 者】盖冬雪;任洪林;卢士英;胡盼;孟宪梅;刘熙;宋德刚;金雯;张嵩

【作者单位】吉林大学人兽共患病研究所,人兽共患病教育部重点实验室,长春130062;吉林工商学院,粮油食品深加工吉林省高校重点实验室,长春130000;吉林大学人兽共患病研究所,人兽共患病教育部重点实验室,长春130062;吉林大学人兽共患病研究所,人兽共患病教育部重点实验室,长春130062;吉林大学人兽共患病研究所,人兽共患病教育部重点实验室,长春130062;吉林工商学院,粮油食品深加工吉林省高校重点实验室,长春130000;广泽乳业有限公司,长春130000;广泽乳业有限公司,长春130000;吉林大学人兽共患病研究所,人兽共患病教育部重点实验室,长春130062;吉林大学人兽共患病研究所,人兽共患病教育部重点实验室,长春130062

规模化制备高纯度牛奶外泌体工艺方法的建立及其分子与细胞生物学活性鉴定

规模化制备高纯度牛奶外泌体工艺方法的建立及其分子与细胞生物学活性鉴定

第47卷第3期2021年5月吉林大学学报（医学版）JournalofJilinUniversity（MedicineEdition）Vol.47No.3May2021

DOI：10.13481/j.1671⁃587X.20210331

规模化制备高纯度牛奶外泌体工艺方法的建立及其分子

与细胞生物学活性鉴定

杨晶1,2,徐铭枝2,张东伟2,董亚楠2,王伊2,宋海峰1,2

（1.安徽医科大学特殊环境组学教研室，安徽合肥230000；2.中国人民解放军军事科学院军事医学

研究院生命组学研究所特殊环境组学研究室蛋白质药物国家工程研究中心，北京102206）

［摘要］目的目的：建立一种规模化的牛奶外泌体纯化工艺，用于实验室制备和工业规模生产，并评

价牛奶外泌体的分子与细胞生物学活性。方法方法：取市售多种全脂或脱脂牛奶，以外泌体提取金标准

——超速离心法（UC）作为对照，采用多种化学前处理方法去除乳蛋白，切向流超滤技术（TFF）

进一步去除残留的乳蛋白，并实现牛奶样品的初纯与浓缩，多模式色谱法（BE-SEC）精纯牛奶外泌

体，采用纳米流式细胞术（NanoFCM）检测牛奶外泌体的粒径、颗粒浓度和纯度，透射电子显微镜

（TEM）观察牛奶外泌体的形态表现，高效液相色谱（HPLC）验证牛奶外泌体的尺寸和纯度，Westernblotting法检测牛奶外泌体特异性蛋白的表达，，基因本体（GO）富集分析差异表达微小RNA

（miRNA）的候选靶基因，DAVIDBioinformaticsResources6.8和KOBAS软件检测京都基因和基因

组百科（KEGG）通路中目标候选基因的统计富集度，CytoFlex流式细胞术检测细胞对牛奶外泌体的

摄取情况，流式细胞术检测牛奶外泌体作用后Caco-2细胞凋亡率。结果结果：工艺研究，磷酸钠沉淀法在

操作便利性、方法稳定性和产品质量方便均优于其他预处理方法。TFF法可进一步去除残留乳蛋白并

可实现液体浓缩目的，有效衔接至下游BE-SEC精纯方法。以该三步工艺所得外泌体样品经TEM成

基于微通道电化学传感器的牛奶体细胞定量检测方法研究

基于微通道电化学传感器的牛奶体细胞定量检测方法研究

２０１４年第３期（总第２０６　试验研究　试验研究　基于微通道电化学传感器的牛奶体细胞定量检测方法研究　张学超　陈至坤　崔传金　（河北联合大学电气工程学院河北唐山０６３０００）　摘要本文以随机采集的新鲜牛奶作为研究对象，测取牛奶细胞电容、温度和细胞大小百分比３参数，建立预测体　细胞含量的神经网络模型，模型对Ｎ、Ｔ、１、２级奶样的预测正确率分别为：７３．５６％、６５．７８％、８９．０３％、９４．３２％。结果　表明，微通道电化学传感器检测牛奶电容的变化与细胞含量相关程度较高，检测精度随着体细胞含量的增加而提高。　关键词牛奶体细胞电容微通道检测　中图分类号：ＴＳ２５２．７　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７．１７３３（２０１４）０３—０００１．０３　奶牛乳腺炎（Ｃｏｗ　Ｍａｓｔｉｔｉｓ）是指奶牛乳腺组织由病原　微生物感染所引起的炎症反应，是奶牛所有疾病中发病　率最高，危害最为严重的一种疾病，美国每年因奶牛乳　腺炎造成的经济损失高达２Ｏ亿美元【ｌ＇２】。中国每年的牛奶　产量为３５５５．８万ｔ【３】，而中国广东气候炎热潮湿，奶牛的隐　性乳腺炎平均月发病率为３０％，季度平均发病时间为　１３％，受感染的奶牛平均感染时间为两个季度，所以控制　奶牛隐性乳腺炎的发病率显得尤为重要【４】。　新鲜牛奶中的体细胞数量（ｓｃｃ）与奶牛乳腺炎【５Ｉ６】、牛　奶质量密切相关。不同患病程度的乳腺炎奶牛，其体细　胞数量不同、细胞大小百分比也不同【１　。体细胞含量已经　作为许多国家监控牛群健康状况、牛奶质量和牛奶定价　收购的重要指标ｆ　。因此，如何实现牛奶中体细胞的准　确、快速、在线检测具有重要意义。　传统体细胞数检测存在检测时间长、操作复杂、成　本高和不能在线检测的问题【　．９】，而使用电参数检测法来　检测体细胞数量，并与美国加州牛乳腺检测方法　（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　Ｍａｓｔｉｔｉｓ　Ｔｅｓｔ，ＣＭＴ）［１０】相对比，来间接判断奶牛　乳腺炎患病程度、牛奶质量，是未来乳品检测行业发展　的主流方向，而电检测方法具有快捷方便的特点和在线　检测的应用前景［９】。　在电导率检测乳腺炎中，温度对牛奶的电导率影响　很大…】。但是，目前从细胞电容的角度研究电容值、细　胞含量和细胞大小百分比之间关系的文章比较少。Ｘｉｏｎｇ　ｚ　Ｑ［１２】等研究了在发酵过程中，发现生物量与电容值之间　的关系之间存在线性关系和Ｓｈｒａｍｉｋ　Ｓｅｎｇｕｐｔａ［　】等研究了　大肠杆菌在培养基上生长代谢的情况，发现微生物数量　与电容值之间也存在线性关系。这都是因为微生物、细　胞的表层是不导电的原生质膜结构【Ｈｌ。当具有完整膜结　构的微生物处于电场中时，在电场力作用下微生物会表　现出微小电容效应，微生物含量与电容值呈正相关［１３，１５］。　本文通过微通道电化学传感器测取不同细胞含量新　鲜奶样的电容值，用电容、温度和细胞大小百分比３参数　建立预测体细胞含量的神经网络模型，以其达到准确、　快速、在线诊断奶牛乳腺炎和评判牛奶质量的目的。　１材料与方法　１．１主要仪器设备　日本ＨＩＯＫＩ３５３２．５０　ＬＣＲ￣Ｊ试仪、ＢＣＤ－２１９ＳＫＤＥ冷藏　柜、高精度温度计（精度为０．００１℃）、培英ＴＨＺ．Ｃ恒温振荡　器、奥林巴斯ＣＸ２１生物光学显微镜等。主要数据分析处　理采用Ｍａｔｌａｂ７．３软件。　１．２试验方法　１．２．１奶样采集奶样采自１００多头正常生理期…的同一　品种黑白花奶牛。采样时先用温开水擦拭乳头，然后用　７５％的酒精对乳头进行消毒，并用医用棉签擦干，弃去前　两次挤出的牛奶，再进行奶样采集。每个乳区的牛奶分　别挤入５０ｍｌ干净的带有编号玻璃瓶内密封。在运输过程　中放入装有冰袋的隔热泡沫塑料盒内进行保鲜。最后将　当天采集到的奶样带回实验室测试，来不及马上测试的　奶样需４＂Ｃ冷藏保存，防止牛奶变质影响测试。　１．２．２　细胞含量测定　牛奶中体细胞含量的测定采用改　进的显微镜直接计数法。奶样取回后，将装有奶样的奶　样瓶放入恒温振荡器中，在４０℃的恒温水浴锅中震荡　１５ｍｉｎ后取出【Ｊ　，使得细胞均匀地悬浮在牛奶中，同时配　置碘酊染液：每毫升生理盐水中滴加质量分数为２％的碘　酊３滴，混匀即可，现用现配。再用移液枪吸取０．１ｍｌ的奶　样注入编号试管内，再用移液枪吸取１．９ｍｌ碘酊染液注入　试管内，轻轻摇动，混合均匀，静置３～５ｍｉｎ。最后用移　液枪吸取少量染色后的奶样（约半滴）轻轻接触盖玻片和计　数板的结合处，让其自动流入并充满计算室，然后进行　显微镜计数，在目物镜１５￣４０的放大倍数下，将计算室四　角４个大方格内的全部体细胞按顺序计数；调节显微镜倍　数，计算不同直径范围内的细胞占细胞总数的百分比。　

基于电容的牛奶体细胞含量检测方法研究

基于电容的牛奶体细胞含量检测方法研究

基于电容的牛奶体细胞含量检测方法研究

摘 要：本文以随机采集的新鲜牛奶为研究对象，测取牛奶的电容、温度和体细胞数，建立了用电容和温度来预测体细胞含量的神经网络模型，模型对n、t、1、2级奶样的预测正确率分别为：63.33%、55.55%、85.00%、91.66%。结果表明，牛奶电容的变化与体细胞的含量变化有密切的关系，细胞浓度越高检测的准确度就越高。

关键词：牛奶；电容；体细胞；检测方法

中图分类号：ts252.7 文献标识码：a

新鲜牛奶中的体细胞数量（somatic cell count，简称scc）与奶牛乳腺炎、牛奶质量密切相关。通常用每毫升牛奶中的体细胞数表示，体细胞含量已被许多国家当作监控牛群健康状况，牛奶质量和牛奶收购定价的重要指标[1]，如何实现牛奶中体细胞的准确快速检测具有重要的意义。

在众多的体细胞检测方法中，电检测方法最为快捷方便，郭庆[2]等多人研究了牛奶电导率与体细胞含量的关系。

但是很少有人从细胞电容的角度研究电容值的大小与细胞含量的关系，事实上，xiong z q等研究了发酵过程中，生物量与电容之间的关系，并发现两者之间存在线性关系[3]，这是因为细胞和细菌的膜是由电导率极低的双层磷脂分子构成的，当完整的细胞和病菌处于电场中时，膜内的离子在电场力作用下移动到细胞膜表面时将受电导率极低的膜的束缚而停留。电荷在细胞膜表面积累使细

胞膜充电，细胞就成为一个微小的电容器，细胞越多，电容越大[4]。

本文通过测取不同细胞含量的新鲜牛奶样品的电容值和牛奶温度，建立起预测体细胞含量的神经网络模型，以期达到最终应用于快速准确检测牛奶质量，诊断奶牛乳房炎的目的。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

日本hioki3532-50 lcr测试仪；bcd-219skde冷藏柜；高精度的温度计（精度为0.01℃）；培英thz-c恒温振荡器；奥林巴斯cx21生物光学显微镜。主要数据分析处理软件采用matlab 7.3 （the