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选修三
P2 基因工程核心：构建重组DNA分子定向改造生物的技术
实质：基因重组
是狭义的遗传工程（广义的遗传工程泛指把一种生物的遗传物质（细胞核、染色体脱氧核糖核酸等）移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。）
理论基础：DNA是生物遗传物质的发现、DNA双螺旋结构的确立、遗传信息传递方式的认定
技术保障：限制性核酸内切酶、DNA连接酶（前两者为基因的分离和重组提供了必要的手段）和质粒载体的发现与应用
限制性核酸内切酶：识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶
细菌中分离出
对DNA分子上不同的特定的核苷酸序列进行识别和切割
切割的是磷酸二酯键
粘性末端、平末端
将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个粘性末端
识别序列eg GAATTC
DNA连接酶：作用：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起，形成的DNA分子成为重组DNA分子
DNA聚合酶需要模板，DNA连接酶不需要
连接的是磷酸二酯键
质粒：能够自主复制的小型双链环状DNA分子，在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，是一种特殊的遗传物质
质粒作为载体的条件：1、能自我复制
2、具有切割位点
3、有标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择
质粒可以从真核生物（酵母菌），微生物中获取
质粒可在自身细胞、受体细胞、体外（PCR技术）复制
载体：质粒、λ噬菌体（前两者能把外源基因载入到大肠杆菌等宿主细胞中）、植物病毒、动物病毒（后两者把外源基因分别载入到植物细胞和动物细胞内）
P5 基因工程的原理和技术
基本原理：让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细胞中稳定和高效地表达
步骤：一、获得目的基因
方法一：目的基因的序列已知：化学合成（胰岛素基因）or 聚合酶链式反应（PCR）扩增｛在短时间内形成大量DNA片段，DNA复制形成的是整个DNA
分子｝or 反转录法（已知RNA→cDNA）
PCR:体外的小试管中通过酶促反应有选择的大量扩增特定DNA片段的技术高温DNA解旋
方法二：序列未知，从基因文库中获取
二、形成重组DNA分子（基因工程的核心）
通常用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA，然后用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子
三、将重组DNA分子导入受体细胞
常用的受体细胞：大肠杆菌[人胰岛素、人生长激素、白细胞介素-2]、枯草杆菌、酵母菌（真核）[α-干扰素、乙型肝炎疫苗等蛋白质产品]和动植物细
胞[生物新品种]
Eg 用质粒作为载体，宿主细胞应该选择大肠杆菌。用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞（胞吞进入）四、筛选含有目的基因的受体细胞
经过培养，目的基因能和质粒一起在宿主细胞内大量扩增
五、目的基因的表达
Eg 转入了人胰岛素原基因的大肠杆菌，可以合成人胰岛素原。进一步加工（内质网、高尔基体）后可获得具有生物活性的胰岛素
检测和筛选目的基因的其他方法：①采用DNA分子杂交技术（目的基因为探针）
②核酸分子杂交法（标记的目的基因作探针与mRNA杂交）
③抗原抗体杂交法←检测是否表达
P9 基因工程的应用
转基因植物：时间短、克服远缘亲本难以杂交
转基因动物：省时省力
基因工程药物：胰岛素（大肠杆菌）
干扰素：是病毒侵入细胞后成熟的糖蛋白
抗病毒、抗细胞分裂和免疫调节等多种生物学功能，是治疗病毒性肝炎和肿瘤的药物（并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作
用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细
胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强
抗病毒能力。）
乙型肝炎疫苗：乙肝抗原在酵母菌中表达成功
基因治疗：向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗目的（原有的缺陷基因一般不作处理，一般只在当代发挥作用，不影响下
一代，载体常用逆转录病毒）
无性繁殖：不经过异性生殖细胞的结合，直接由母体产生下一代个体的繁殖方式（保持了亲本的遗传性状，一次产生后代的数量可以很大，可以迅速扩大其种
群的数量）
P18克隆技术指从众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或特定类型细胞的操作技术
分子水平上，基因克隆指某种目的基因的复制、分离过程，通常是将生物材料的遗传物质（DNA）用限制性核酸内切酶切成片段，插入到载体
分子中，并将所得的重组载体转入宿主细胞中，通过宿主细胞的无性
繁殖使其扩增，然后再用某种探针选择、钓取目的基因
克隆的条件：①具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞②能有效调控细胞核发育的物质③完成胚胎发育的必要的环境条件
P21 植物的克隆技术基础：植物组织培养
植物细胞全能性的基本含义：植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性，因而都具有发育成完整植株的潜能
植物组织培养程序：①配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的含0.7%~1%琼脂的培养基，倒在灭菌试管中凝固成半固体②从消毒的根、茎或叶上切取一
些小组织块③将组织块放在固体培养基上获得愈伤组织④以适当配比
的营养物质和生长调节剂诱导愈伤组织，直到再生出新的植株植物组织块切口处得细胞在创伤的刺激下发生脱分化成为分裂的细胞，并且可以继续不断地进行分增殖
愈伤组织：创伤表面的薄壁细胞团组成的新生组织。高度液泡化，细胞壁薄，不定型诱导出芽（分裂素多）和根（生长素多）的顶端分生组织
适量的激动素和细胞分类素配比可以诱导芽的分化；适量的吲哚乙酸及适当减
除其他某些激素，则可以诱导生根
Or 将含有愈伤组织的试管放在摇床上，通过液体悬浮培养可以分散成单细胞（细胞质丰富，液泡小，细胞核大胚性细胞）→细胞团→球形胚→心形胚→胚状体→
完整植株
用纤维素酶果胶酶水解细胞壁，可以获得分离的植物细胞原生质体（细胞中有代谢活性的原生质部分，包括质膜、细胞质、细胞核），用适当方法进行原生质体培养
也可获得新植株
植物体的每个生活细胞（根、茎、叶、花药、子房及幼胚），即使是已经高度成熟和分化的细胞，都保持了恢复到分生状态的能力，都具有遗传上的全能性
由于不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间遗传性的差异，细胞全能性的表达程度大不相同
某些作物在多次继代培养后，会丧失细胞全能性的表达能力（原因：①有染色体畸变，细胞核变异或非整倍体产生，且其结果是不可逆的②细胞或组织中激素平衡被打破③细胞对外源生长物质的敏感性发生该改变斯由于其他各种原因产生了缺乏成胚性的细胞系）
植物原生质体的获得方法：在0.5~0.6mol/L的甘露醇溶液环境（较高渗透压）下用纤维素酶和果胶酶混合处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞，将细胞壁消化除去，获得球形的原生质体
原生质体融合方法：物理法：离心振动，电刺激
化学法：聚乙二醇（PEG）
杂种细胞形成标志：细胞壁的形成
P27 动物的克隆
技术基础：动物的细胞和组织培养
动物细胞培养的原理：细胞增殖
动物细胞培养：机械消化，胰酶消化后分散成单个的细胞
因为细胞间并非彼此独立而是在生命活动中相互依存，所以某种程度上也
像体内一样呈现一定的组织特性
动物组织培养：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。动物组织培养过程中可以伴随组织分化
组织培养过程中哦主要的生命活动仍以细胞为单位
由于细胞的运动、变化，使得培养物的组织成分也发生结构和功能变异，
结果长期的培养经常只能是单一类型的细胞保存来，最终成了简单的细胞
培养
细胞培养分为原代培养：从机体取出后立即进行的细胞、组织培养
传代培养：将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶
