药用植物内生菌的分离和鉴定共17页PPT资料

植物内生真菌一、内生真菌的概念内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。

这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成的孢子（或者孢子果）不容易识别。

真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。

与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。

草本植物内生真菌侵染种子内部，播种后，真菌随着幼苗的生长和植株的发育成熟而生长，这些真菌没有吸器，出现在茎、叶、花序组织，而不出现在根内，这一点与菌根真菌不同。

受侵染的植株在营养生长阶段不表现出被内生真菌侵染的特点，但是，当植物开花的时候，就可以观察到浸染的真菌。

与内生真菌容易混淆的一个概念是内生菌根，菌根是高等植物的根与真菌形成的共生联合体，内生苗根是菌根当中的一种类型，内生菌根的共同特征是根的表面不产生菌套，仅有稀疏的外生菌丝，菌丝在根部皮层组织的细胞间延伸，但不产生哈蒂氏网，菌丝体可侵入细胞内部，并形成不同形状的吸器，而宿主植物的根一般无形态及颜色的变化。

故内生菌根用肉眼很难识别。

二、内生真菌的一般特征内生真菌存在于根以外的植物组织细胞，可以用显微镜观察，也可以通过纯培养把它们分离出来进行研究。

分离内生真菌时要对植物组织进行表面消毒，然后切成小片放在培养基上培养3～5天，内生真菌就生长在培养基上，可根据孢子和菌丝的特征，对它们进行分类鉴定。

可以按常规方法把内生真菌从多种植物上分离出来，已经发现的内生真菌包括许多子囊菌和半知菌、一些担子菌及少量的卵菌。

主要的内生真菌包括药用Chloroscypha和Lophodermium（散斑壳属）中的一些种类以及Cryptoxline、Cryptosporriopsis（拟隐孢菌属）、Phomopsis（拟茎点霉属）和 Phyllosticta（叶点霉属）中的一些种类。

其中许多可以从植物组织中偶然分离到。

这类真菌的共生生活方式与其占主导地位的腐生生活方式来讲，似乎是次要的。

贵州白苞蒿抗肿瘤、抗氧化内生真菌的筛选与鉴定白苞蒿Artemisia lactiflora是一种重要的药用植物。

对已分离获得的54株白苞蒿内生真菌粗提物分别采用MTT法和DPPH法进行体外抗肿瘤和抗氧化活性筛选，并采用分子生物学方法对筛选出的活性内生真菌进行鉴定。

结果显示，共计10株（18.5%）白苞蒿内生真菌粗提物对人骨髓白血病细胞系（HL-60）、人乳腺癌细胞系（MCF-7）和人前列腺癌细胞系（PC-3）生长的抑制活性较好，其中以链格孢属GYBH47菌株粗提物的抗肿瘤活性最佳，对3种肿瘤细胞株的生长均有抑制作用；共计2株（3.7%）白苞蒿内生真菌粗提物的抗氧化活性较好，其中，拟茎点霉属GYBH42菌株粗提物同时具有抗氧化活性和细胞毒活性。

表明贵州白苞蒿内生真菌是寻找有价值的生物活性成分的潜在资源，其生物活性成分值得进一步研究和开发。

标签：白苞蒿；内生真菌；细胞毒活性；抗氧化活性；分子鉴定1 材料1.1 内生真菌贵州白苞蒿内生真菌54株，由本实验室分别自贵州省贵阳、毕节和威宁地区白苞蒿的根、茎和叶中分离获得，保存于贵州大学西南药用生物资源教育部工程研究中心药用真菌实验室。

1.2 肿瘤细胞HL-60（人白血病细胞）、MCF-7（人乳腺癌细胞）和COLO205（人结肠癌细胞）均购于南京凯基生物技术有限公司。

1.3 试剂试药阿霉素购于美国Sigma公司，DPPH自由基购于日本和光纯株式会社，Vit E购于中国食品药品检定研究院，真菌基因组DNA快速抽提试剂盒、Master Mix、异丙醇和真菌 5.8S rDNA通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG），ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）均购于生工生物工程（上海）有限公司。

乙酸乙酯（EtOAc）、二甲基亚砜（DMSO）、乙醇等试剂购于贵州鼎国生物技术有限公司，均为分析纯。

1.4 培养基马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基用于活化菌种；马铃薯葡萄糖液体（PDB）培养基用于培养种子液；查氏（Czapek′s）培养基用于菌株鉴定；肿瘤细胞株采用RPMI 1640培养，使用前加入10%胎牛血清。

第二章药用微生物
2.1 药用微生物资源开发利用的历史
2.1.1 微生物之间的拮抗现象
一种微生物的生长如果造成对周围其他微生物生长的 抑制，这种现象就叫做“拮抗”。 • 1874年，W.Roberts发现某种霉菌能抑制细菌的生长， 1876年，J.Tyndall也报告了一种青霉对各种细菌的拮 这是世界上最早报告的拮抗现象。 • 抗作用。次年，法国著名细菌学家巴斯德（1822—1895） 发现炭疽杆菌培养物被杂菌污染后对人体的感染力下降，
（5）老抗生素及其半合成衍生物不断发现新的生物学活性， 开发新的应用。
①环孢菌素A是老抗生素开发新用途的一个典型例子。原
先作为抗真菌药物进行研究时，免疫抑制作用是不希望有的 一种副作用，后来反其道而用之，开发成为一个优良的用于 器官移植的免疫抑制剂。同样，原先作为一般抗生素进行研 究的布雷青霉素和雷帕霉素，现在也已成为临床应用的优良 免疫抑制剂。
②我国学者陶佩珍等最近发现，国外早期发表由吸水链霉 菌产生的弱抗菌抗生素格尔德霉素具有很强的抗病毒活性。 表2-2还列举了另外一些抗生素所具有的其他药理活性。 一种抗生素的某一潜在药理活性一旦被证明，如果需要的话， 往往可以通过化学修饰来增强这种活性。
表2-2
药理活性
一些抗生素的其他药理活性
抗生素
20世纪70年代至90年代，微生物产生的各种免疫激活剂也 受到人们的青睐。如普通裂褶菌产生的裂褶菌素，从采绒革盖 菌中提取的云芝多糖，由香菇中提取的香菇多糖，以及一些病 原细菌的灭活细胞或细胞成分或细胞提取物，已在临床上用来 进行抗癌、抗病毒的辅助治疗，或用于治疗慢性支气管炎及创 伤性溃疡。 上述抗生素（抗微生物和抗癌活性物质）以外的
1951年、秦藤树等的嗜癌菌素，1952年Hackman等

二、核对文献
原始文献，即指第一次发现该种（新种）植物 的植物工作者，根据该植物的标本，描述记载 其特征予以初次定名的文献。
三、核对标本
模式标本，即指发表新种时所描述的植物标本。
第三节 性状鉴定
生药性状鉴定是运用人体的感官看、摸、闻、 尝及水试、火试等直观的方法，对生药的性状， 包括形态、大小、色泽、表面、质地、断面、 气味等特征作为依据而进行鉴别的方法。它是 我国中医药工作者鉴别生药中长期积累的丰富 经验之总结，故又称传统经验鉴别。该法简单、 快速、易行，是行之有效保证质量的重要鉴定 方法之一。性状鉴定主要观察完整的生药及饮 片。
摸——就是用手触摸生药，以判断生药
的质地及折断现象，通常用硬软、结松、 轻重、韧脆、弹柔以及粉质、角质、油 润、绵性、柴性、粘性等词来形容。
嗅——是直接嗅闻完整的生药，或于剥
碎、搓揉、折断时所能闻到的气感。
尝——是用舌尖接触生药表面，或取少
量生药入口咀嚼能感觉到的味感（剧毒 药尝味要小心，尝后立即吐出并漱口）。
二、根茎类生药：以植物的地下茎入
药，包括根状茎(根茎)、块茎、鳞茎或 球茎。根茎类生药表面有节和节间，节 上常见有退化的鳞片状叶，有时可见叶 痕和芽痕，有不定根或根痕。蕨类植物 根茎的表面常有鳞片或鳞毛，有的周围 密布整齐的叶柄基。
观察根茎类生药的横断面 双子叶植物根茎呈放射状结构，中心有明显的
4、木类生药：木类生药系采自树木形成
层以内的部分，通常以心材入药。一般将木材 锯截成段，或劈成条块或刨成薄片。观察其形 状、色泽、表面纹理与斑块、质地、气味，以 及横切面、纵切面所呈现的年轮、射线等纹理。
第二节 原植（动）物鉴定
生药的原植（动）物鉴定（又称分类学鉴定、 来源鉴定），是应用植（动）物分类学的知识， 对生药的来源进行鉴定，确定其正确的学名、 以确保应用中品种的准确性。这是生药鉴定的 基础，也是生药生产、资源开发及新药研究工 作的基础。

三、药用真菌的制种及菌种保藏
3．菌种分离 --组织分离法 （1）子实体消毒：选取幼嫩、健壮、饱满、无病虫的子实体，切去菌柄，放入洗 净的盘内，放在安装有紫外灯的接种箱内照射20～30min。 （2）接种块选择部位：根据药用真菌种类，选择合适部位的接种块。菇体肥厚的 种菇的菇柄中部纵切一刀，撕开，挑取菌盖和菇柄交界处的一小块组织；对个体细 小的伞菌子实体，也可采用子实层作组织分离材；对子实体组织层较薄，质地较韧， 菌丝数量极少，分离难度较大的胶质菌类的组织分离，一般分离时剖取尚未展开的 耳片胶质团内部的组织块。 （3）接种块切取：在已消毒的接种箱内，用消毒刀片切取黄豆粒大小组织块，放 入菌种瓶内培养基上培养。
等措施调节光照、温湿度及空气流通适宜等以符合药用真菌生长的要求 • 在段木栽培中要及时防治霉菌和病虫害（线虫、白蚁等）
四、药用真菌的生产方式及工艺
（二）生产工艺
2．工艺要点 （1）段木栽培 5）采收
从子实体分化形成幼小子实体到采收一般需要3～7天，要做到适时采收。采收时应去 除残留的泥土、杂质、腐烂虫蛀部位等，然后按产品质量标准进行加工。
四、药用真菌的生产方式及工艺
（二）生产工艺
2．工艺要点 （1）段木栽培 3）接种：是进行段木栽培中的关键步骤。接种前必需检查段木组织是否枯死，水分状况 是否适中，再根据真菌的生物学特性，选择合适的接种时间、接种量、接种密度。
• 根据菌丝生长的最低温度适当提早接种，可减少杂菌污染 • 根据段木大小和气温变化灵活掌握接种量 • 根据树径粗细、质地软硬、气温高低决定所砍接种口的密度，树径粗宜密，树径细
三、药用真菌的制种及菌种保藏
（三）原种和栽培种的制作 4．培养 接种后，将种瓶(袋)置于适温下培养。菌种瓶初放时，应直立于床架上，当 菌丝吃料后，再将其横放。菌种瓶（袋）根据气温可单层或多层叠放，隔4～5天转动 或调换位置，以利于受温一致并避免培养料水分的沉积；要经常检查，及时去除出现 杂色、黏液及菌种死亡的瓶(袋)；逐渐降温（当菌丝长至料深的1/2时，降温2～3℃， 以免料温升高，并有壮丝作用）；注意菌龄（原种约30～40天、栽培种约20～30天菌 丝长满，再继续培养7～10天）。

科技成果——农业内生菌资源分离鉴定技术成果简介植物内生菌（endophyte）是指能定殖在健康植物组织内，并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物。

植物内生菌的研究已逐步成为生命科学领域一个新的研究热点，受到国内外植物学家和微生物学家的关注。

研究已经证实，内生菌在植物体内不仅积极地生存着，而且还能产生多种生物学作用，如固氮、促进植物生长和对病虫害的防治等作用。

人们注意到植物-内生菌这种和谐共生，互利共栖的生命形式，可能是未来生态型农业发展的一条重要思路。

所以，在“资源节约型，环境友好型”产业已逐渐成为国内外公认主流发展方向的今天，开展植物内生菌的研究不仅对植物微生物学科的研究对农业可持续发展也有重要的实践意义。

选择有研究和应用价值的模式植物和内生菌种是进行内生菌研究的先决条件，从农村地区一些重要作物（包括主要蔬菜）中分离多种内生菌是本项研究的首要工作。

随着这些大量植物内生菌资源的分离，植物内生菌研究就可以进一步深入。

本人目前已得到一批有重要植物促生作用的细菌及其培养技术，可以转化为工业化生产。

技术水平目前，国际上关于这些内生菌的生物学作用及在农业生产中的应用，属于应用性研究，包括固氮作用或菌肥、作物抗病抗逆、果蔬抗菌保鲜等；我们已对手头内生菌与宿主植物的相互作用机制这一的核心问题进行了深入系统的研究，从根本上对内生菌做出恰当评价，为解释其生物学作用及实际应用提供依据。

本项目负责人从事内生菌研究十余年，技术水平高，成熟。

市场前景由于内生细菌具有在应用与环境微生物学研究中的重要价值，而其在资源节约型，环境友好型现代农业中的应用已逐渐成为国内外公认主要发展方向。

内生菌与植物的联合作用机制是当前国际上内生菌研究中最受关注的问题。

本项研究，一方面可以从农村地区重要作物分离鉴定的具有多种生物学作用的内生菌，具有自主知识产权和自主创新性的独特优势，为其进一步应用于农业生产，减少或替代化肥和农药的施用；另一方面，本项研究有助于揭示内生细菌和宿主植物联合运作机制。

着土层加深而减少 。硝化细菌属好 氧性化能 自养 细菌 ， 适宜 生长在有机质含量较低的有氧环境 中。东湖芦苇湿地土壤 的 含氧量 比西湖芦苇香蒲沼泽 的高 ， 有机质含量低 ， 上层土壤 的
通气 状 况 比下 层 的 好 ， 影 响 硝化 细 菌 分 布 的 主要 因素 。 是 ２４ 反 硝 化 细 菌 、 氮 细 菌 的分 布 ． 脱
一
林 下 或 沟 边 草 丛 中 ， 西 省 各 地 都 有 少 量 分 布 ， 江 西 省 江 在 宜 春地 区 有 大 量分 布 ， 国家 二 级保 护植 物 ， 为 同时 又 被 列 为 国
际濒危植物。绶草具滋 阴益气 、 凉血解毒 、 润肺止 咳 、 消炎解
毒 之功 效 。绶 草具 有 较 高 的药 用 价 值 ， 经 从 中 分 离 出 多 种 已
江苏农业科学
２ １ 第 ６期 ００年
刘紫英．濒危 药用植物绶草内生真菌 的分离与鉴定 ［ ］ Ｊ ．江苏农 业科学 ，０ ０ ６ ：５ ５ ５ ２ １ （ ） ５ ３— ５
濒危 药 用植 物 绶 草 内生 真菌 的分 离 与鉴 定
刘 紫英
（ 春 学 院 化 学 与生 物 工 程 学 院 ， 西 宜 春 ３６ ０ ） 宜 江 ３０ ０
明， 内生 真 菌 能 够 产 生 与 宿 主 植 物 相 同 或 相 似 的 化 学 成 分 ， 国外 有 研 究 报 道 ， 内生 真 菌 （ ｈ ｏｔ ｉ ｓｐ ） 促 进 绶 Ｒ ｉ ｃ ｎａ ｐ ． 能 ｚ ｏ
作者简介 ： 刘紫英 （９ ９ ） 女 ， １７ 一 ， 江西万年人 ， 硕士研究生 ， 讲师 ， 从事 药 用 植 物 生 物 技 术 的 教 学 与 研 究 工 作 。 Ｅ —ｍａ ：ｉｇｉｕ ０ ８ ｉ ｙｎｚｉ２０ ＠ ｌ ｌ

蓝中压迫种子，镜检着色的菌丝。
三、内生真菌与药物
1. 遗传载体
内生真菌生活在树干、叶柄、根 和叶部的细胞内。由于它们有可能作 为遗传载体使用，因此在生物技术上 很有用处。
2.药物源
1995年销路最好的20种药物中，有 6种来自真菌；1983年至1994年间批准 的520种新药中，39％是天然产物或它 们的衍生物。因此天然产物对制药工业 极其重要。
❖ 内生菌的产孢
典型的内生真菌在植物组织内部 以菌丝的形式存在，在植物体外看 不见。只有在他们产孢时才能看见， 由此通常是季节性的、短暂的。
❖ 种群的分布
一般讲，在某种寄主上的各种叶部内生真 菌是由相对稳定并紧密结合在一起的群体组成 的，其特征是由少数几种优势种所决定的。
在任何一种寄主上除了能稳定地分离出的 按作物分组的内生真菌外，如对内生真菌的植 物寄主进行调查无一例外地都会得出一串长长 的偶见寄主名录；场所对这些种类的分布的影 响比寄主的影响大。
可用常规方法鉴定，有的要接种到灭菌的原寄主 组织上或用近紫外灯光照射，对其产孢有促进作用。
❖ 林下落叶的分离
在枯枝落叶分解初期，可分离出在针叶 林树冠的叶部组织和干部组织中生活的内生 真菌。许多常见的内生真菌代表着早期潜伏 性入侵并定殖在组织中的真菌。它们能迅速 生长和产孢，这是它们对衰老的反映。这些 真菌可在枯枝落叶分解初期分离出来。
一、内生真菌的基本特征 二、分离与培养 三、内生真菌与药物 四、内生真菌与生物防治 五、相互关系研究方法
一、内生真菌的基本特征
植物内生真菌的生物学作用
内生真菌长期生活在植物体内的特殊 环境中，并与宿主协同进化，在演化过程 中二者形成了稳定的生态关系，一方面内 生真菌可从宿主中吸收营养供自己生长需 要，另一方面内生真菌在宿主的生长发育 和系统演化过程中起重要的作用，可通过 自身的代谢产物或借助于信号转导作用对 植物体产生影响 。

理（ 酒精 ｌ ｎ 次氯 酸钠 （ ． ） ｍｎ 酒精 １ ｉ一 ｍｉ－ ３５ ５ ｉ一 ％ ａ ｒｎ 无菌水清
发价值 。目前植物 内生菌 已成为植物学 、 微生物学 、 植物保护
学及植物育种学等多种学科的研 究重 点。 植物 内生菌 的研究 工作 已在全球开展起来 ， 丰富的药 用植 物资源中包含着更为 丰 富的内生真菌资源 ， 于药 用植 物内生真菌及其活性物质 对
菌株编号
Ａ１Ａ２ Ａ 、 ４ 、 、３Ａ Ｂ１Ｂ 、 ３ 、２ Ｂ Ｃ１Ｃ 、 ３ 、２ Ｃ
分离率 （ ） ％
８． ３３ ｌ－ ７２ ６７ ．
铃薯 ２ ０ ， 碎成 丁 ， ０ ｇ切 加水 煮沸 ３ ｍｉ， ０ ｎ 以纱 布滤去 残渣 ， 滤
液加 蒸馏 水 补 足 至 ｌ ０ｍＬ Ｏ ０ ，加 入 １～ ０ 琼 脂 加 热 溶 化 ， ５２ｇ 再
加 ２ｇ ０ 葡萄糖溶解 ， 分装 ， 口膜 密封瓶 １ ，２ ℃灭菌 ２ ｍｎ 封 ２ １１ １ ０ｉ
备用 。
实验试剂 ：５ 精 、． ７ ％酒 ７０ ％次氯酸钠溶液 、无水葡萄糖 、
琼脂
ห้องสมุดไป่ตู้
２ 各 菌 株 的分 离 频 率 ． 表 ２中数 据 显 示 老 叶 中分 离 到 的 Ａ 、 ２是 优 势 菌 群 即 ３Ａ
也将为茶叶的深度开发开辟新 的空 间。 本实验以华南茶区普
遍栽培 的英 红九号茶树 品种 为对象 ， 对老 叶 、 叶和嫩茎 三 嫩 个部位进行 了内生菌的分离和纯化 ， 以期可 以为研究茶树 二 级代谢与内生微生物的关 系提供一定 的基础。
一
二 、结果与分析
１ ．内生 真 菌 的 分 离 率
茶树样 本 ：０ 年 ３月在 华南农业 大学 实习茶 园采用 ２１ １

安徽农学通报，Anhui Agri，Sci，Bull，2020，26（23）西藏2种乌头属药用植物茎内内生菌的分离与鉴定马红梅王璐璐段双全*（西藏大学理学院，西藏拉萨850000）摘要：目的：探究西藏工布乌头和露蕊乌头2种药用植物植株茎内内生菌。

方法：采用培养基培养法和载玻片法对分离得到的菌株进行形态学分析，并利用分子生物学技术提取菌株DNA进行测定。

结果：从2种西藏乌头属药用植物中获得的2株菌株，均属于半知菌亚门曲霉属环绕亚属黑色组的真菌。

关键词：西藏；药用植物；内生菌；DNA；乌头属中图分类号Q944.54文献标识码A文章编号1007-7731（2020）23-0026-03Isolation and Identification of Endophytes in the Stem of Two Medicinal Plants of Aconitum in Tibet MA Hongmei et al.（College of Science，Tibet Univercity，Lahasa850000，China）Abstract：Objective：This paper mainly explores the Isolation and identification of endophyte in medicinal plant of Aconitum in Tibet.Methods：The strains of endophyte were isolated and analyzed morphologically by medium cul⁃ture method and slide method.DNA of each strain was extracted by molecular biology technology for determination. Results：The two strains obtained belonged to the black fungus group of Aspergillus，Monilia-ceous，Hyphomyceta⁃les，Hyphomycetes，Deuteromycotina.Key words：Tibet；Medicinal plants；Endophytes；DNA；Aconitum内生菌（Endophyte）一词最早是由德国科学家de Bary首先提出的，早期定义是指生活在植物组织内的微生物。

王利娟等： 植物内生真菌分离培养的研究方法
: 8
水冲洗表面残留的消毒剂。家庭用的 ! " # $ %漂 白剂用水稀释至& ’! ( ) ’ 就是最常用的表面消
［ ］ & 毒剂 ， 由于商业次氯酸盐溶液浓度、 可用有效
有时将表面活性剂 （如 ; ） 和消毒剂结合 < 2 2 . = > ) 使用， 消毒后将组织在无菌水或 8 ) ’! 9 : ’ 的乙 醇中浸泡(? 6 .以除去残留的消毒剂。其他的消 毒剂在内生菌研究中并不常用， 包括硝酸银、 氯化 汞 （升汞） 、 福尔马林 （甲醛水溶液） 、 乙醇或丙烯氧 化物。由于升汞的毒性残留以及对自然环境的破 坏作用， 现在国外很少使用， 而是使用一些具有相
高等植物是复杂多样的， 它为各种各样的微 生物提供生存环境。这些微生物中主要是真菌， 有的生活在叶和嫩枝等的表面 （称为表生菌） ， 有 的生活在叶内部组织中 （称为叶内生菌） ， 有的则 生活在树皮中 （称为树皮内生菌） ， 还有的生活在 木材中 （如木质部内生菌和木材腐生菌） 。健康植 物内部组织的内生菌引起越来越多科学家的兴 趣， 从目前己经研究过的植物来看， 可以推断内生 真菌在植物体内是普遍存在的。通过对内生真菌 和宿主专一性分析， 平均每种宿主有! * 种专性 内生真菌， 按地球上有 " 内生真 * 万种植物计算， 菌总数可能超过 # $ $
［ ］ ’ 根菌和假菌根菌） 应属于内生菌 。目前， 关于内
等植物很可能是隐匿着未知真菌的宝库。本文主 要从! 个方面对内生真菌的研究方法进行了简要 综述。
> 植物内生真菌的定义
要弄清内生真菌的定义， 首先要明白内生菌
生菌的概念范畴仍有很大的争议， R = A @ 2 7 2提出的 ［ ］ ’ 内生菌概念被广泛接受 。 植物内生菌包括内生细菌、 内生放线菌和内 生真 菌 。 然而， 过 去’ $ 6中 ， = 7 F G < A =和= 7 F G 3 J K

2020.08种植技术金莲花，又称旱荷、旱莲花寒荷，为毛茛科金莲花属的植物，一年生或多年生草本。

金莲花有清热解毒，消炎止痛，清热散风，平肝明目的功效。

为探究金莲花内生真菌次生代谢产物活性，通过对兴隆山金莲花的内生菌分离纯化，确定其种类和数量并分析其形态学特征，为后期探究具有高度开发价值的有生物活性的天然产物新型生物资源奠定基础。

1　实验材料1.1　实验所用植物的材料来源采自兰州市榆中县兴隆山的金莲花，由指导老师郭俊珍老师鉴定。

图11.2　仪器与设备量筒、玻璃棒、烧杯、培养皿、锥形瓶、电子分析天平、VS-1300-U超净工作台、生化恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱1.3　药品与试剂75%酒精、升汞0.1%、葡萄糖、琼脂粉、注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。

2　实验方法2.1　培养基的制作称取200g土豆，洗去泥沙，去皮切块，利用蒸馏水煮沸至土豆成泥。

用八层纱布过滤并将滤液置于烧杯中，向烧杯中加入20g葡萄糖和25g琼脂，搅拌溶解并转移至1000mL的量筒中进行稀释。

分装，高压蒸汽锅灭菌，待溶液降至约55℃时加入青霉素钠和硫酸链霉素于超净工作台中倒平板，接种。

2.2　内生真菌的培养从采样袋中挑选出叶，茎，根无损伤且无虫害的金莲花植株用无菌水冲洗干净。

在超净工作台中依据组织切割法将金莲花的叶、茎和根切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，将切割好的小块于无水乙醇浸泡2min，无菌水漂洗2～3次，而后于0.1%的升汞溶液中浸泡2min再次用无菌水漂洗2～3次后，用无菌滤纸吸干表面的水分。

将灭菌后的小块置于制好的培养基上，每板放置5块片，密封膜密封，于27℃的培养箱中培养3～7d。

将最后的漂洗液涂布于一个平板内一起放入培养箱中，观察是否有细菌长出，以检验上述操作是否灭菌完全。

3.3　分离纯化菌落出现在切口。

根据菌落形态，色差和生长时间，挑取每个菌落的边缘菌丝并转移到分离培养基平板进行再培养。

置10- 15 m in后, 每一样品各取上层澄清液50 LL 分别涂布在培养基( NA、KB和TSA ) 平板上, 每种培养基涂布3皿, 28 e 黑暗培养48- 72 h, 计算每一平板的菌落数. 表面消毒后, 在研磨前取50 LL 无菌水冲洗液涂布平板;或是通过组织印迹试验, 将最后一次清洗的植物组织在培养基平板上印一下, 按上述条件培养48 h, 观察有无菌落产生, 以验证采用该消毒方法是否能杀死供试材料表生微生物. 根据菌落形态、颜色等挑取单菌落, 划线分离、纯化后保存、备用.在融化并冷却至45 e 的NA 培养基中加入待测病原菌的悬浮液, 其中每100 mL 培养基加 1 mL 细菌悬浮液, 倒入平板. 采用点接法将内生菌接种于NA平板上, 每个平板上等距离点接5株不同的内生细菌菌株, 每组进行2次平行试验, 在恒温箱中28 e 下培养, 2 d后观察有无抑菌圈生成.（2）采用组织切块法, 进行表面消毒,再用灭菌的蒸馏水清洗, 检验灭菌效果。

内生细菌的分离前,将采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分,切取支根110 cm 长的小段, 须根切成115 cm的小块, 进行组织表面清毒, 棉花根部切段后经无菌水冲洗3次,用75% 酒精浸泡5m in、7m in、10m in后, 然后分别用011% 升汞溶液处理 4 m in、6 m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复3次。

最后用无菌水冲洗4次, 最后一次冲洗液涂3种不同培养基平板, 26~ 28e 下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗4次,取上清液涂抹于培养基上。

以无菌水冲洗为对照试验。

培养2d后观察灭菌效果, 直到彻底表面灭菌, 再进行最后的内生菌分离。

将组织块在研钵中充分研磨成匀浆,取上清匀浆涂抹于3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态。