蛋白质双向电泳实验流程

蛋白质双向电泳实验流程

一．样品制备

1.研磨

研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。

2.加入8mLTris饱和酚（pH8.8）和8mL抽提液，在通风橱内研磨30s。

先加8mLTris饱和酚，Tris饱和酚会变成固体，此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。接着加入8mL抽提液，也需将固体的抽提液研磨成小块。等三者混匀后，将粉末转移至45 mL tube。

3.振荡30min。

室温静置，待tube中固体变成液体后，开始振荡。振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。

4.10000g，4℃，10min。将酚相（top phase）转移至45mL tube。酚相（top phase）可置于冰上。

酚相应该是绿色的，水相应该是淡黄色的。

5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。

振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。

6.10000g，4℃，10min。将酚相（top phase）转移至45mL tube。

7.沉淀酚相。取一定体积（是酚相的5倍）的0.1M乙酸铵/甲醇溶液（–20℃保存）于酚相（45mL tube）。振荡30s，–20℃培育1h或过夜。

8.清洗沉淀

①15 min，20,000 g，4℃。弃上清。

②加10mL 0.1 M乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。–20℃沉淀30min。

③15 min，20,000 g，4℃。弃上清。

④加入10 mL乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。–20℃沉淀30min。

⑤15 min，20,000 g，4℃。弃上清。

⑥加10mL 80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。–20℃沉淀30 min。

⑦15 min，20,000 g，4℃。弃上清。

⑧加入10 mL 80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。–20℃沉淀30 min。

⑨15 min，20,000 g，4℃。弃上清。

⑩加入10 mL 100%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。–20℃沉淀30 min。

○1115 min，20,000 g，4℃。弃上清。

9.用药匙将离心管中的蛋白质样品取出，置于硫酸纸上，将样品制成粉末。

将粉末分装到2 mL的离心管中，每管装20 mg。用封口膜将离心管封口，做好标记，置于-20℃保存。

二．裂解

1.取出样品，加入样品20体积的裂解液.

这一步需要样品尽量浓，因此加入裂解液的体积要小。

2.置于冰盒，摇1.5h。

3.冰浴，超声15min。若有必要可再摇0.5h、超声15min。

4.35,000g，4℃离心1h。

5 将上清转移至1.5mL tube中，取1μL进行定量，其余储于-20℃

6.进行定量

①取样本液1μL和裂解液1μL于1.5mL tub中，加入500 μL Precipitant solution，震荡一下，室温下静置5 min。

②迅速加入500 μL Coprecipitant solution，混合均匀。

③20,000g 离心5 min。弃上清，再离心，弃上清。

④沉淀加入100 μL Copper solution后，震荡一下，再加入400 μL ddH2O，将沉淀完全溶解。

⑤快速加入1 mL Working color reagent，混合均匀后，室温静置20 min。

⑥使用480 nm 波长测吸光值。

⑦与蛋白质标准校曲线比较，计算出样本液的蛋白质含量。

三．第一相

1.依据定量的结果取样品于1.5 mL tube中，加再水化液于样品中（至总体积450μL），充分混匀。

2.35,000g，4℃离心0.5h

3.转移上清，准备上样

①用移液器吸取样品溶液，将样品注入到胶条槽内

②撕取胶条。手拿胶条的正极，用镊子将胶条表面的塑料片撕去（从正极端撕）。再用镊子夹住负极端，放入胶条槽中，字体朝上，有字端朝向胶条槽尖端。

③.加覆盖油，盖上胶条槽的盖，将胶条槽放到IPGphor中。

4.进行IEF。

Prot# 4. 7 steps

S1 30V 8:00Hr

S2 50V 4:00Hr

S3 100V 1:00Hr

S4 300V 1:00Hr

S5 500V 1:00Hr

S6 1000V 1:00Hr

S7 8000V 11:00Hr Number of strips

四．平衡

1.用镊子夹住胶条的负极（无字端），胶面朝左，背面朝右。背面贴着滤纸，吸干覆盖油。

2.取15mL（24cm）的SDS平衡缓冲液于管中，称取150 mg（100g/10mL）DTT。将试管置于摇床上，平衡15 min。（实验前配好）

3.DTT平衡完毕后，将试管中液体倒掉。用1×SDS Electrophoresis Buffer清洗胶条，清除附着在胶条表面的DTT。清洗2～3次。

4.取15mL（24cm）的SDS平衡缓冲液于管中，称取250 mg（100g/10mL）碘乙酰胺。将试管置于摇床上，平衡15 min。（实验前配好）

5.平衡完毕后，将试管中液体倒掉。用1×SDS Electrophoresis Buffer清洗胶条2～3次。

五．第二相

1.制12.5%分离胶，并灌制胶板（在开始跑一相后完成），4℃保存，用前一小时取出。

2.从试管中取出胶条，用镊子夹住负极，正极朝左，放入分离胶的上端。

3.用滤纸吸干分离胶上端的水。

4.加琼脂糖密封液。

5.将胶板转移至电泳槽中，补充电泳上、下级液。

6.电泳：设置3.5w/24cm胶条，30 min，同时打开循环水浴。

7.电泳30 min后，设置17w/24cm胶条，时间为OFF。

8.溴分蓝条带电泳至凝胶底部停止电泳。

六．染色、脱色

1.电泳结束后轻轻翘开两层玻璃板，取出胶条，并切掉凝胶左角（酸性端）作标记。

2. MilliQ H2O冲洗凝胶表面。

3.反转玻璃板将凝胶转入染色盒中。

4.加入染色液约500mL。

5.摇床染色过夜。

6.弃去染色液，添加脱色液，进行脱色。

备注：

1.抽提液

0.1 M Tris-HCl 13.34 mL

10 mM EDTA（292.25） 4 mL

0.4% 2-ME 800 μL

0.9 M sucrose（342.29） 61.612 g

Milli Q To 200 mL

2. 0.1M乙酸铵/甲醇溶液

乙酸铵(77.08) 3.8454 g

100%甲醇 To 100 mL

3. 裂解液

Unea (Fw 60.06) 7 M 0.424 g 2.12g 4.24 g 变性剂 chaotropes

Thiounea (Fw

76.12) 2 M 0.152 g 0.76g 1.52 g 变性剂 chaotropes

CHAPS 4% (W/V) 0.04 g 0.2g 0.4 g 表面活性剂 sufactants

DTT (Fw 154.25) 40 mM 0.0062

g 0.031 g 0.062 g 还原剂 reducingagents

Pharmalyte

(pH3-10) 2% 20 μL 100 μL 200 μL

MilliQ H2O 1 mL 5 mL 10 mL

蛋白酶抑制剂 先配置为母液，再根据蛋白提取液的体积适量加入 （4%总体积）

4.水化液

Unea 7 M 0.424 g 2.12

g 4.24

g 离液剂 chaotropes

Thiounea 2 M 0.152 g 0.76

g 1.52

g 离液剂 chaotropes

CHAPS 2% (W/V) 0.02 g 0.1 g 0.2 g 表面活性剂

sufactants

IPG buffer

(pH3-10) 0.5%

(V/V) 5 μL 25 μL 50 μL

Bromophenol

Blue 0.002% 2 μL 0.1%

solution 10 μL 20 μL

DTT 2.8 mg (使用前加入) 14

mg 28

mg 还原剂

reducingagents

MilliQ H2O 1 mL 5 mL 10

mL

5．4×Resolving Buffer（母液，pH 8.8的Tris碱）

Tris-base (Fw 121.1) 181.7 g 18.17 g 90.85 g 36.34 g

MilliQ H2O 750 mL 50 mL 250 mL 100 mL

HCl (Fw 36.46) Adjust to Ph 8.8 pH 8.8 pH 8.8 pH 8.8

MilliQ H2O (or dd H2O) to 1 L to 100 mL 500 mL 200 mL

6. Monomer stock solution（单体储液）

7. 10%SDS

Sodium dodeuylsnlfate (MW 288.38) 10 g

Distilled or deioized water To100 mL

8. 分离胶（12.5%）

分离液12.5%

Acrylamide stock 21 mL 33.6 mL 42 mL 84 mL

1.5M pH8.8 Tris-HCl 12.5 mL 20 mL 25 mL 50 mL

water 16 mL 25.6 mL 32 mL 64 mL

10% SDS 0.5 mL 0.8 mL 1 mL 2 mL

10% AP 170 μL 272 μL 340 μL 680 μL 1

mL

10%TEMED 17 μL 27.2 μL 34 μL 68 μL 28

μL

50 mL 80 mL 100mL 200 mL

9. Bromophenol Blue Stock Solution（溴酚蓝储藏液）

Bromophenol blue 1% 100mg 10mg

Tris-base 50mM 60mg 6mg

MilliQ H2O

to 10ml 1mL

10. SDS Equilibration Buffer（SDS平衡缓冲液）

Unea

(Fw60.06) 6 M 18.0175 g 144.14 g

Tris-HCl

Ph8.8 50 mM 1.675 mL 13.4 mL

SDS

(Fw288.38） 2% (W/V) 2.0 g 8.0 g

Glycerol 30% (V/V) 17.25 mL纯甘油 138 mL

Bromophenol

blue 0.002% (W/V) 200 μL of 1% solotion 800 μL 1%

solotion

MilliQ H2O to 100mL to 400mL

11. SDS Electrophoresis Buffer （SDS电泳缓冲液）

最终浓度 10×

Tris-base (Fw 121.1) 25 mM 30.3 g

Glycine (Fw 75.07) 192 mM 144 g