MIUR-VNTR在乌鲁木齐市耐药结核分枝杆菌基因分型中位点稳定性的研究

文章编号：1001-764X（2011）08-609-03·综述·

结核分枝杆菌的分子分型技术研究进展*

代旭磊1a，柳爱华1b，宝福凯1a，汪亚玲2，文霞1a，赵勤2，吕松琴2（1．昆明医学院a．微生物学与免疫学教研室，b．生物化学与分子生物学教研室，昆明650031；2．昆明市第三人民医院，昆明650032）关键词：结核分枝杆菌；分子分型；技术中图分类号：R446．5文献标志码：A结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）是细胞内致病菌，流行病学资料显示，我国结核病呈高患病率、高耐药率、高死亡率、高感染率、病例发现率低等特点［1］。结核病的诊断主要根据病史、胸片、痰培养、涂片抗酸染色等。提供快速、敏感、特异、可靠、简便、适合临床应用的实验室检查技术是目前研究的重点之一。MTB基因分型技术能更准确地预测疾病的暴发流行及传播模式，主要是根据其插入序列或重复序列通过扩增或酶切杂交获得指纹图进行分析。本文就MTB的分子生物学分型方法的研究进展作一综述。1结核分枝杆菌复合群标准分型方法限制性片段长度多态性（IS6110-RFIP）分析是应用最广泛的MTB基因分型方法。IS6110属插入序列IS3家族，可根据其在基因组中插入序列数目和位置的差异而区分不同的菌株。IS6110-RFLP具有较高的分辨率、较好的重复性及很强的鉴别菌株的能力，在国际上得到广泛的认同与应用，已被用作MTB基因分型的金标准。但也具有一些局限性：如对IS6110拷贝数少（基因组DNA＜5～10μg）或无IS6110的菌株难以鉴定；程序复杂，操作费时、费力；图谱识读困难，需要软件支持；需菌量大，DNA提取失败率高；不同实验室以及不同实验者之间的数据难于比较，缺乏可信性［2］。为此国际上逐渐建立一些以PCR为基础的DNA指纹分型方法，通过多种分型技术、多步分析的方法替代标准指纹分型，以达到快速鉴定的目的。2以PCR为基础的DNA指纹分型方法PCR技术是利用体外基因扩增方法，将少到几个拷贝病原微生物的DNA扩增到常规可检测水平。对MTB这类生长十分缓慢的病原菌的检测和分型有独特的意义。以PCR为基础的分型技术如：间隔区寡核苷酸分型技术（spoligotyp-ing）、数目可变的串联重复序列和MTB散在分布重复单位分型（VNTR-MIRU）、扩增片段长度多态性分析和荧光扩增片段长度多态性分析（AFLP-FAFLP）、双重复元件PCR、连接酶介导PCR（LMPCR）、混合接头PCR（mixed-linkerPCR）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、聚合酶链反应/单链构象多态性分析（PCR/SSCP）、以肠杆菌基因间重复序列为引物的PCR（ERIC-PCR）等，各法原理与特点见表1。以PCR为基础的分子分型技术弥补了IS6110-RFIP的许多不足，但单独应用分辨力均不够强，两种或多种PCR方法联合运用可获得更高的分辨力。spoligotyping为目前使用最广泛的MTB的PCR分型方法，商品化的spoligotyping试剂盒已上市；VNTR-MIRU技术得出的分型更具多样性，被美国疾病预防控制中心推荐为MTB基因分型的首选方法，适用于做全球流行病学研究。3基因芯片技术1999年，Troesch等［11］用在位合成的方法开发了首块诊断结核病的芯片，该芯片所用的探针包括两部分：一部分是有分枝杆菌种间多态性的16SrRNA基因片段，借以鉴别MTB与NTM；另一部分则是用于分析利福平耐药菌株rpoB基因突变的发生情况。该技术具有高通量、集成化、自动化的特点；可用作分子流行病学调查工具，探查全基因组，用全序列作为DNA芯片的模板，分析MTB和其他分枝杆菌属分离株的基因组，识别相同和不同的序列区，可揭示重要的临床和流行病学现象。目前已用于MTB的分类鉴别和药敏试验。Mikhailovich等［12］用基因芯片检测MTBrpoB基因的点突变和基因重排来判定MTB对利福平的耐药性，在利福平耐药菌株中检出30个DNA突变体（约占所有耐药模式的95%），检测时间缩短到1．5h。张万江等［13］研制一种MTB耐药性筛查的基因芯片，该芯片能快速、准确、高效地检测MTB对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇的耐药性。利用该基因芯片检测5株临床MTB分离株的耐药性，与常规药敏检测结果相符。Park等［14］以ITS为靶序列用寡核苷酸阵列从临床分离菌株中成功鉴定了19种分枝杆菌。Sanguinetti等［15］开发出一种微电子阵列，检测手段精确，操作简单，需样本少。理论上基因芯片具有高通量、集成化、自动化、平行性、精确可靠等优点，但由于成本高、现有的技术发展不够成熟，致使其检测效率与预期尚有差距。4变性高效液相色谱变性高效液相色谱（DHPLC）的原理基于离子对反向液相色谱技术，通过独特的DNA分离基质，对特定的PCR反应产物进行分离。目前该技术可用于对微生物进行检测鉴别。Mohamed等［16］用DHPLC建立了MTB和牛分枝杆菌的pnc-A基因差异性图谱，能迅速鉴别出标本中是否含两种分枝杆菌亚型。石瑞如等［17］用DHPLC异源双链突变方法鉴别MTB·906·临床检验杂志2011年11月第29卷第8期ChinJClinLabSci，Nov．2011，Vol．29，No．8

２０１０年１１月第ｌ７卷第３３期　疾病防控　

新疆部分地区结核分枝杆菌ｒｐｏＢ基因突变　

与对利福平耐药相关性检测　

王仙　，袁俐ｔ，李永祥　，吴万贵　，姜素华　，贾卫　

（１．石河子大学医学院，新疆石河子８３２０００；２．新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心，新疆乌鲁木齐８３０００２）　

［摘要】目的：了解新疆部分地区结核分枝杆菌ｒｐｏＢ基因的突变与对利福平耐药呈水平的关系。方法：采用基因芯片　对耐利福平菌株ｒｐｏＢ基因进行检测。结果：３６株结核分枝杆菌利福平初始耐药分离株，对利福平高度耐药２５株，低　

度耐药１１株。基因芯片检测显示３３株存在突变，低度耐药株突变主要在５２６位，少数在５３１位；高度耐药株突变主　

要在５２６位、５３１位，其中３株未见突变，３株为５２６和５１６位联合突变。结论：本地区结核分枝杆菌对ＲＦＰ的低度　

耐药表现为ｒｐｏＢ基因的点突变。而高度耐药则表现为ｒｐｏＢ基因的５２６位、５３１位点突变及联合突变形式。　

『关键词１结核分枝杆菌；ｒｐｏＢ；耐药水平　冲图分类号】Ｒ９７８．３　［文献标识码】Ｂ　［文章编号１　１６７４—４７２１（２０１０）１１（Ｃ）一１４１—０１　

结核分枝杆菌耐药菌株的出现是结核病疫情再度复燃　

的重要原因。目前多数研究表明对利福平（ＲＦＰ）的耐药与　

ｒｐｏＢ基因突变关系密切，已成为开发快速检测方法的重要指　标，而有关耐药基因突变与耐药程度有否关联．国内外文献　

的报道不尽相同　。在对新疆和田地区的监测报告也显示多　数耐药菌株均有利福平耐药现象口１，检测对利福平的耐药有　重要意义，而对于耐药程度是否与突变有关联，对于研发针　对本地的快速检查试剂有重要意义。本研究对利福平的不同　

程度耐药菌株进行ｒｐｏＢ基因芯片分析，为耐药程度检测提供　依据。　

１材料与方法　

１．１菌种与标本来源　Ｈ３７ＲＶ标准株由中国药品生物制品鉴定所菌种保藏中　心赠予，每批试验均以该菌株作为参照比对。３６株结核分枝　

２０１４，３０（２）　中国人兽共患病学报　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａ１　ｏｆ　Ｚｏｏｎｏｓｅｓ　１２１　ＤＯｌ：１０．３９６９／ｃｊｚ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—２６９４．２０１４．０２．００３　西藏藏族结核分枝杆菌临床分离株的　ＭＩＲＵ—ＶＮＴＲ基因多态性分析与评价　石　荔　，董海燕。，巴　桑　，西　洛　，索朗德吉　，赵秀芹　，万康林　摘要：目的　了解西藏地区藏族人群中结核分枝杆菌２４位点ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ的基因多态性及其评价。方法　应用欧盟　推荐的２４位点ＭＩＲＵ—ＶＮＴＲ分型方法，将本次分型结果与ＭＩＲＵ—ＶＮＴＲｐｌｕｓ数据库进行比对，并应用ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ５．０软件　进行聚类分析。结果　５７７株结核分枝杆菌分为３４７种基因型，其中２９９株分为６９个基因簇，另２７８株表现为独特的基因型。　ＭＩＲＵ３１、Ｑｕｂｌｌｂ２、Ｑｕｂ２６、Ｑｕｂ４１５６ｃ、Ｍｔｕｂ２１、ＭＩＲＵ２０和ＭＩＲＵ２６七个位点对西藏地区藏族人群中结核分枝杆菌临床分离　株的分辨力较高，另１７个位点的分辨力较低，其中ＭＩＲＵ２４位点分辨率为０。结论　西藏地区藏族人群中结核分枝杆菌ＭＩ—　ＲＵ—ＶＮＴＲ分型具有良好的多态性，且该地区以现代型结核分枝杆菌为流行优势菌。　关键词：结核分枝杆菌；基因型；ＭＩＲＵ—ＶＮＴＲ　中图分类号：Ｒ３７８　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２—２６９４（２０１４）０２—０１２１—０４　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｔｉｂｅｔａｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｂｙ　ｖａｒｉａｂｌｅ－ｎｕｍｂｅｒ　ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｏｆ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｕｎｉｔｓ　ＳＨＩ　Ｌｉ　，ＤＯＮＧ　Ｈａｉ—ｙａｎ　，ＢＡ　Ｓａｎｇ　，ｘＩ　Ｌｕｏ　，ＳＵＯ　Ｌａｎｇｄｅｊｉ　，ＺＨＡＯ　Ｘｉｕ—ｑｉｎ。，ＷＡＮ　Ｋａｎｇ—ｌｉｎｚ　（１．Ｔｈｅ　Ｆ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｔｉｂｅｔ　Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎ，Ｌａｓｈａ　８５００００，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｆ　Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０２２０６，Ｃｈｉｎａ）　ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｉｂｅｔａｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｖａｒｉａ—　ｂｌｅ－ｎｕｍｂｅｒ　ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｏｆ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｕｎｉｔｓ（ＭＩＲＵ—ＶＮＴＲ）ｗｉｔｈ　２４　１ｏｃｉ．Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　５７７　ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｔｉｂｅｔａｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　２４　ｌｏｃｉ　ＭＩＲＵ—ＶＮＴＲ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ　５．０　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｂｌａｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄａｔａ　ｏｆ　ＭＩＲＵ—ＶＮＴＲ　ｐｌｕｓ　ｉｎ　ｗｅｂｓｉｔｅ　ｏｆ　ｈｔｔｐ　｜ｌ　．ｍｉｒｕ—ｖｎｔｒｐｌｕｓ　ｏｒｇ．Ｏｆ　５７７　Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　３４７　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　２９９　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　６９　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ａｎｄ　２７８　ｓｔｒａｉｎｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｕｎｉｑｕｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ．Ｓｅｖｅｎ　ｌｏｃｉ　ｏｆ　ＭＩＲＵ３１，Ｑｕｂｌｌｂ２，　Ｑｕｂ２６，Ｑｕｂ４１５６ｃ，Ｍｔｕｂ２１，ＭＩＲＵ２Ｏ，ａｎｄ　ＭＩＲＵ２６　ｈａｄ　ｈｉｇｈ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ　ｐｏｗｅｒ　ｆｏｒ　Ｔｉｂｅｔａｎ　Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ｔｈｅ　ｄｉｓｃｒｉｍｉ—　ｎａｔｏｒｙ　ｐｏｗｅｒ　Ｏｆ　ｏｔｈｅｒ　ｌｏｃｉ　ｗｅｒｅ　ｌｏｗ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ　ｐｏｗｅｒ　ｏｆ　ＭＩＲＵ２４　ｗａｓ　ｚｅｒｏ．Ｔｈｅｒｅ　ａｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉ—　ｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｔｉｂｅｔａｎ　Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ　ｍｏｄｅｒｎ　Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｂｅｉｊｉｎｇ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｗａｓ　ｐｒｅｖａｌｅｎｔ　ｉｎ　Ｔｉ—　ｂｅｔ　ａｒｅａｓ．　ＫＥＹ　Ｗ０ＲＤＳ：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ｇｅｎｏｔｙｐｅ；ＭＩＲＵ—ＶＮＴＲ　Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．３０８６０２４３）　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：Ｗａｎ　Ｋａｎｇ－ｌｉｎ，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｋａｎｇｌｉｎ＠ｉｃｄｃ．ｃｎ　西藏是中国结核病疫情最严重的地区之一。本　国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３０８６０２４３）资助　通讯作者：万康林，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｋａｎｇｌｉｎ＠ｉｃｄｃ．ｃｎ　作者单位：１．西藏自治区第一人民医院感染科，拉萨８５００００；　２．中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京　１０２２０６　研究从来自西藏７个地区的藏族结核病患者中共分　离出５７７株结核分枝杆菌，应用欧盟推荐的２４位点　ＭＩＲＵ—ＶＮＴＲ基因分型方法进行分子流行病学研　究，并分析了２４个ＶＮＴＲ位点的分辨率，旨在了解　

国匾』ｋ叠堂苤蠢２Ｑ鳗生！旦筮箜鲞箍！翅！咝』幽璺堡：地幽强２Ｑ鳗。№ｌ：箜：№：！

结核分枝杆菌基因分型方法研究进展

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焦伟伟（综述）申阿东（审校）

【摘要】结核病是单一病原体所致死亡的主要原因。近年来，人口流动的增加和耐药结核分枝杆菌

的增多更加剧了结核病在人群间的传播，因此必须加强对结核感染的控制和监测。分子流行病学，尤其

是基因分型方法是监测结核病传播的有效途径。目前国内外广泛使用的基因分型方法有：插入序列

６１ｌＯ限制性片段长度多态性、间隔区寡核苷酸分型法、多位点数目可变串联重复序列分析、单核苷酸多

态性分析及缺失分析等。该文就这些分型方法作一综述。

【关键词】分枝杆菌，结核；基因分型

１９９８年结核分枝杆菌（ｎｌｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ岫ｎｌｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，

ｗｒＢ）标准菌株Ｈ３７Ｒｖ全基因组测序工作完成，结核病

的研究进入了基因时代。随着分子生物学技术的发

展，结核病分子流行病学研究的新技术也在逐步建立。

由于ＭｒＢ基因组具有重复序列多态性的特点，用于菌

株间的鉴别独具优势。ＭＩＢ基因分型技术在结核病

的暴发流行、耐药结核菌的传播、内源性复发和外源性

再感染等方面解决了传统方法难以证实的问题。本文

就目前常用的一些ＭＩＢ基因分型方法的原理、特点以

及应用进行综述。

ｌ插入序列６１１０限制性片段长度多态性方法

插入序列（ｉｎｓｅｎｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ，璐）是可移动的基因

元件，通常小于２．５ｋｂ，它在基因组内可发生转位、重

复或缺失。１９９０年１１１ｉｅｒｒｙ等最先描述了Ｉ：ｓ６１１０，其全

长１３５５ｂｐ，末端含有不完整的２８ｂｐ反向重复序列，是

ＩＳ３家族的一个成员，完整的序列特异地存在于ＭｒＩＢ

复合群中，拷贝数从Ｏ。２６不等。１９９３年，啪Ｅｒｎｂｄｅｎ

等提出了以Ｉｓ６１１０为基础的ＤＮＡ印迹杂交的标准化

操作方法，即ＩＳ６１１０限制性片段长度多态性（ＩＳ６１１０．