乳制品中L-羟脯氨酸的测定

HPLC法测定复方阿胶膏中4种氨基酸的含量目的建立复方阿胶膏中4种的含量测定方法。

方法采用HPLC法，Shimpack ODS C18柱（4.6mm×250mm，5um），以乙腈-0.1mol/L乙酸钠溶液（用冰乙酸调节pH值至6.5，7：93）为流动相A，以乙腈-水（4：1）为流动相B，进行梯度洗脱。

结果L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸分别在12.46～124.6ug/mL、23.62～236.2ug/mL、8.47～84.7ug/mL、19.14～191.4ug/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999，n=6），平均加样回收率分别为97.91%、97.77%、97.67%、97.65%，RSD分别为1.70%、1.18%、1.31%、1.29%（n=9）。

结论本法准确可靠，可用于复方阿胶膏的质量控制。

标签：高效液相色谱；复方阿胶膏；-羟脯氨酸；甘氨酸；丙氨酸；L-脯氨酸复方阿胶膏为安徽中医药大学第二附属医院院内制剂，由阿胶、黄芪、枸杞子、核桃仁等八味中药组成，以养血益气为主，滋补肝肾、健胃消食、温肺润肠为辅。

主用于气血两虚证所致的诸多疾病。

其中阿胶为君药，阿胶中的主要有效成分为蛋白质、多肽和氨基酸。

该方原采用凯氏定氮法测总氮含量为质量标准，但由于该制剂为复方制剂，干扰较大，该方法测得的结果误差较大，不够准确。

因此在参考文献的基础上，于2015年10月～2016年1月期间，采用HPLC法以甘氨酸、丙氨酸、L-羟脯氨酸和L-脯氨酸四种阿胶中含量较高的氨基酸为定量指标，对复方阿胶膏进行质量标准研究。

1.仪器与试药LC-20ATvp岛津液相色谱仪（日本岛津公司）；SPD-20Avp检测器（日本岛津公司）；梅特勒AG285电子分析天平（瑞士）；梅特勒xp56型百万分之一电子天平（瑞士）；JK-300型超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）。

复方阿胶膏（安徽中医药大学第二附属医院，批号：20150306、20150313、20150320），缺阿胶阴性制剂为自制。

离子色谱法检测化妆品中L—羟脯氨酸方法研究先进的仪器设备和一流的分析方法是离子色谱法的两个重要组成部分。

离子色谱法有许多不同类型的分析方法，不同的方法适用于不同类型的样品和化合物。

对于L-羟脯氨酸的分析，离子色谱法有以下几个关键步骤：1. 样品制备样品制备是离子色谱分析中的第一步，是确保结果准确可靠的重要步骤。

制备的方法根据样品的类型和要求的结果不同而不同。

渗透吸附树脂是常用的样品制备方法，树脂具有良好的选择性和吸附性能，可以“捕获”待分析的化合物。

2. 色谱柱离子色谱法使用特定类型的柱来进行分析。

选择合适的柱是确保分析精度和可靠性的关键之一，不同类型的柱适用于不同类型的分析。

对于L-羟脯氨酸的分析，通常选择弱离子型离子交换柱，它可以通过离子交换来分离待分析的离子化合物。

3. 分析条件离子色谱法中，分析条件指的是离子交换柱、流速、洗脱剂和检测条件等参数。

分析条件的优化对于提高分析精度和稳定性至关重要。

对于L-羟脯氨酸的分析，一般采用无机离子作为洗脱剂，比如硫酸盐、氢氧化钠等，同时选择合适的检测波长进行检测。

4. 数据处理离子色谱法的数据处理通常是通过计算机程序完成的，可以自动化处理数据、记录结果等。

数据处理的准确性对于结果的可信度也有很大的影响。

除了以上关键步骤，离子色谱法检测L-羟脯氨酸的方法还需要进行一系列的前期处理工作，比如样品取样、提取和洗脱等步骤。

同时，对于不同场合的分析要求，离子色谱法还需要根据实际需要，作出相应的参数调整和优化工作，如进样量、检测波长和流速等方面的调整。

总之，离子色谱法检测化妆品中L-羟脯氨酸是一种有效的分析方法，可以快速、准确的检测到待分析化合物，为化妆品质量监测提供可靠的手段。

在实际应用中，需要根据不同类型的样品和要求的结果，选择合适的分析条件和方法，确保分析结果的准确性和可靠性。

乳及乳制品中有毒有害物质的检测方法作者：任春晓吴丹杨丽霞来源：《食品安全导刊》2014年第05期摘要：本文介绍了乳及乳制品中常见的几种有毒有害物质及其检验方法。

主要包括：L-羟脯氨酸、四环素族药物残留、β-受体激动剂、硝酸盐、苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠，并汇总归纳了比色法、高效液相色谱法、紫外分光光度法等快速检测方法。

经济、快速、简便，可用于大批量的实际检验工作中。

关键词：乳及乳制品有毒有害物质检测方法随着人们生活水平的提高，乳及乳制品需求不断加大，其安全问题备受关注，而对其中有毒有害物质的检测管理直接关系到乳制品的质量安全。

近年来，研究者主要从非法添加物质、抗生素及农药残留、防腐剂及添加剂超标等方面研究其质量问题。

基于此，本文汇总归纳了乳及乳制品中常见有毒有害物质的检测方法，为选择较优检测提供依据，提高了检验效率。

1 皮革水解蛋白皮革水解蛋白粉就是利用皮革下脚料甚至动物毛发等物质，经水解而生成的一种粉状物，因其氨基酸或者说蛋白含量较高，故人们称之为“皮革水解蛋白粉”。

该物质中混进了重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，如果长期食用便会被人体吸收、积累、造成铬中毒，引起人体关节疏松肿大，甚至造成儿童死亡[1]。

目前常用的检测皮革水解蛋白的方法有超声乳成分分析法，比色法测定L-羟脯氨酸，氨基酸自动分析法等[2]。

王衍彬[3]等人运用国际法、超声乳成分分析仪和Foss红外分析仪对掺加了水解动物蛋白的乳制品进行了测定，发现随蛋白粉含量的增加，3种方法检测的蛋白含量数均呈上升趋势，上升幅度超声分析仪最小，最能反映真实的乳蛋白含量。

L-羟脯氨酸是皮革水解蛋白所特有的氨基酸，含量约13.4%，而在其它蛋白中几乎不存在，可以作为判定是否含有皮革水解蛋白的依据[4]。

羟脯氨酸难挥发，在紫外区有微弱吸收，没有荧光基团，运用比色法来测定，选择廉价、易除的过氧化氢作为氧化剂，脱羧生成含吡咯环的物质，选用乙酸锌和亚铁氰化钾为沉淀剂效果最佳[2]。

生鲜乳中皮革水解蛋白的检测及应用陈磊【摘要】为测定生鲜乳中皮革水解蛋白,采用UV法检测农业部生鲜乳比对盲样和2011-2015年兵团9个师的生鲜乳收购站及生鲜乳运输车的生鲜乳,按3:1比例进行抽检样品的L-羟脯氨酸.结果显示:L-羟脯氨酸的浓度在0~1.5 mg/L范围呈良好的线性关系,线性相关系数为0.9993,L-羟脯氨酸的回收率为96.16%~104.84%,相对标准偏差为3.32%,农业部生鲜乳盲样比对结果全部通过,检测634批次生鲜乳均未检出皮革水解蛋白.此检测方法对兵团生鲜乳中皮革水解蛋白的测定提供重要的科学依据.【期刊名称】《草食家畜》【年(卷),期】2016(000)006【总页数】4页(P34-37)【关键词】生鲜乳;L-羟脯氨酸;皮革水解蛋白【作者】陈磊【作者单位】新疆兵团畜牧兽医工作总站,新疆乌鲁木齐 830063【正文语种】中文【中图分类】S879.110.16863 /ki.1003-6377.2016.06.008皮革水解蛋白是利用已经废弃的皮革制品和动物毛发，水解后将其制成粉末状，再掺入到牛奶或着奶粉中去，用以提高奶制品中蛋白质的浓度，这种掺杂有皮革水解蛋白的奶制品食用后，会致使身体消化不良，吸收及利用率降低，长时间饮用会导致人体中毒，影响了人体健康[1]。

2009年2月6日，中国卫生部公布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）》，其中共4个指标，就包含有“皮革水解蛋白”。

检测鲜奶中的皮革水解蛋白，实际就是检测鲜奶中的L-羟脯氨酸[2]。

1.1 主要的试剂和材料L-羟脯氨酸标准品（中国食品药品检定研究院提供，批号111578-200201）；氯胺T、对二氨基苯甲醛、HCl、苯酚、柠檬酸、NaOH、结晶乙酸钠、正丙醇均为分析纯；去离子水。

生鲜乳样品：来自兵团九个师生鲜乳奶站和运输车。

1.2 主要仪器设备TU-1901紫外分光光度仪、水浴锅、电热恒温干燥箱、移液器。

离子色谱法检测化妆品中L—羟脯氨酸方法研究
L-羟脯氨酸是一种重要的天然氨基酸，它在化妆品中具有一定的保湿和抗氧化功能。

为了确定化妆品中L-羟脯氨酸的含量，离子色谱法被广泛应用。

离子色谱法是一种分析方法，通过分离和测定溶液中的离子物质。

它是一种高效快速的方法，适用于分析水溶液中的离子物质。

我们需要准备样品溶液。

将待测化妆品样品溶解在适量的溶剂中，使其达到适合离子色谱分析的浓度。

然后，用0.45μm滤膜过滤样品溶液以去除悬浮物和杂质。

接下来，调节离子色谱仪的工作条件。

选择适当的色谱柱和移动相，并调整流速和温度，以保证分离的效果和分析的准确性。

然后，根据需要的灵敏度和检测范围选择合适的检测器。

常用的检测器包括电导度检测器和紫外检测器。

在进行实际分析之前，需要进行方法的验证和优化。

可以通过构建标准曲线和添加不同浓度的标准品来验证方法的准确性和灵敏度。

为了优化方法，可以利用不同的柱和移动相组合来提高分离效果。

在进行实际分析时，将样品溶液注入离子色谱仪进行分析。

离子色谱仪将会分离样品中的L-羟脯氨酸，并通过检测器进行检测和定量。

根据预先建立的标准曲线，可以计算出样品中L-羟脯氨酸的含量。

通过这种方法，可以确定化妆品中L-羟脯氨酸的浓度，并确保产品质量和安全性。

离子色谱法是一种有效的分析方法，适用于化妆品中L-羟脯氨酸的检测。

通过优化分析条件和进行方法的验证，可以得到准确和可靠的分析结果。

这对于保证化妆品质量和安全性具有重要意义。

原料中羟脯氨酸含量的测定1.材料和试剂1.1材料秦宝雪花牛牛蹄筋：陕西秦宝牧业有限责任公司。

秦宝普通育肥牛、雪花牛肺：陕西秦宝牧业有限责任公司。

秦宝雪花牛棒骨：陕西秦宝牧业有限责任公司。

1.2试剂所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水，或相同浓度的水。

1.2.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L]量取750mL水于2L的容量瓶中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。

冷却至室温后用水定容。

1.2.3缓冲溶液（PH=6.8）包括下列组分：a）26.0g一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）；b）14.0g氢氧化钠；c）78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。

用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL 正丙醇，用水定容。

该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。

1.2.4氯胺T溶液称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL 缓冲溶液溶解。

临用前配制。

1.2.5显色剂称取10.0g对甲氨基苯甲醛，用30mL高氯酸溶液[70%（质量分数）]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。

临用前配制。

1.3羟脯氨酸标准溶液1.3.1标准储备液称取50mg4-羟基-α-吡咯甲酸（羟脯氨酸）于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（1.2.1），用水定容。

该溶液于4℃下可稳定存放1个月。

1.3.2标准工作液移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。

分别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度一次为0.5µg/mL、1.0µg/mL、1.5µg/mL、2.0µg/mL。

临用前配制。

2.仪器和设备3.试样制备用刀将原料在冷冻时（0℃以下）切成小块（约0.5cm3，边长约为8mm）。

将切好的试样装入密封样品盒中，或用耐热塑料袋真空包装，70℃以上保温30min后，冷却。

1羟脯氨酸含量测定2羟脯氨酸标准曲线绘制3试剂的配制【6-7】[6] 李秋营,姚汝琳.细胞中羟脯氨酸的测定.山西医科大学学报.2001,32(6):558-559[7] David J Etherington, Trevor J Sims. Detection and Estimation of Collagen[J]. J Sci Food Agric, 1981,32:539-546柠檬酸缓冲液：柠檬酸钠120g、冰醋酸12mL、柠檬酸46g、氢氧化钠34g 溶解于蒸馏水中，调整pH 值至6.0，然后定容至1000mL。

0.05mol/L 氯胺T 溶液：称取氯胺T 7.05g，溶解于100mL 蒸馏水中，然后加入乙二醇独甲醚150mL，再加入250mL 柠檬酸缓冲液混合均匀。

对二甲基氨基苯甲醛: 试剂 A：取无水乙醇20mL，慢慢加入浓硫酸2.74mL；试剂B：取对二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入无水乙醇40mL，水浴加热使其完全溶解并冷却至室温，然后将A 液慢慢加入B，混合均匀。

3.5mol/L 高氯酸溶液：取27mL 高氯酸，以蒸馏水定容到100mL。

羟脯氨酸标准曲线的绘制羟脯氨酸标准储存液：准确称取L-羟基脯氨酸标准品50mg，加入0.01mol/L 盐酸中溶解，稀释并定容到100mL，在冰箱中保存。

羟脯氨酸标准工作液：吸取羟脯氨酸标准储存液10mL到50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到50mL(临用前配)，浓度为100μg/mL。

4标准曲线绘制分别吸取羟脯氨酸标准工作液1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，用蒸馏水定容到50mL容量瓶中。

以蒸馏水为空白，分别吸取上述标准液1mL，加入1mL 柠檬酸缓冲液和1mL 0.05mol/L 氯胺T 溶液，室温(25 ℃) 氧化10min 后，加入高氯酸1mL(3.5mol/L)，放置10min，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂1mL，在65℃水浴显色10min，冷却后在560nm处测吸光度。

高效液相色谱法测定奶粉中羟脯氨酸含量于淑新;赵连海;王丰琳;孙元社;唐涛;李彤【摘要】In this paper, a method for measurement of hydroxyproline in milk powder by high perform ance liquid chromatography(HPLC)with pre-column derivation was established. 2, 4-dinitrofluorobenzene (DNFB) was used as derivative reagent, and the separation was performed on Elite AAK C18 column (250 mm×4. 6 mm I. D. , 5 μm) with gradient elution of 0.05mol/L sodium acetate and acetonitrile/water (50: 50, V:V) at 27 ℃. The flow rate was 1. 2 mL/min and the detection wavelength was 360 nm. Method val idation was performed. The results showed that the linear range was from 0. 04 to 10 mg/L with a linear correlation coefficient of 0. 9999. The limit of quantification was 30 mg/kg in milk powder sample (S/N = 10). The relative standard deviations of parallel determination (n=5) were 9. 64% and 0. 36% with spiked of 0. 05 mg/L and 8. 0 mg/L respectively. The recoveries were from 95. 94% to 114. 87% in the spiked range of 0. 05~8. 0 mg/L in milk powder. It was indicated that the method was accurate and repeatable for the determination of hydroxyproline in milk powder.%建立了柱前衍生化高效液相色谱法(HPLC)测定奶粉中羟脯氨酸含量的方法.以2,4-二硝基氟苯为衍生试剂,采用Elite AAK C18色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.,5μm)；0.05 mol/L乙酸钠,乙腈/水(50∶50,V∶V)为流动相梯度洗脱；流速1.2 mL/min;检测波长360 nm；柱温27℃.结果表明:羟脯氨酸标准品在0.04～10.00mg/L范围内线性相关系数为0.9999;方法检出限为30 mg/kg(S/N=10)；加标浓度为0.05,8.0 mg/L的平行5次测试结果相对标准偏差分别为9.64％和0.36％；0.05,0.1,0.25,0.5,1.0,2.0,8.0 mg/L7个加标水平测试,加标回收率在95.94％～114.87％之间,加标线性曲线的线性相关系数为0.9998.该方法定量结果准确,满足奶粉中羟脯氨酸含量测定的要求,可以作为判断奶粉中是否违禁添加皮革水解蛋白的依据.【期刊名称】《分析仪器》【年(卷),期】2012(000)002【总页数】4页(P26-29)【关键词】羟脯氨酸;皮革水解蛋白;柱前衍生;高效液相色谱【作者】于淑新;赵连海;王丰琳;孙元社;唐涛;李彤【作者单位】大连依利特分析仪器有限公司,大连116023;大连依利特分析仪器有限公司,大连116023;大连依利特分析仪器有限公司,大连116023;大连依利特分析仪器有限公司,大连116023;大连依利特分析仪器有限公司,大连116023;辽宁大连依利特分析仪器工程技术研究中心,大连116023;大连依利特分析仪器有限公司,大连116023;辽宁大连依利特分析仪器工程技术研究中心,大连116023【正文语种】中文近几年，国内有些乳制品生产企业违禁向乳及乳制品中添加皮革水解蛋白，以提高蛋白质含量，引起社会的广泛关注。

脯氨酸含量的测定方法
脯氨酸是一种氨基酸，在生物体中具有重要的功能和作用。

以下是常见的脯氨酸含量测定方法之一：
1. 高效液相色谱法（HPLC）：HPLC 是目前最常用的脯氨酸测定方法之一。

该方法是利用色谱柱将样品中的脯氨酸与其他化合物分离，并通过比较峰面积或峰高来定量分析脯氨酸。

2. 气相色谱法（GC）：GC 方法需要将样品中脯氨酸进行衍生化反应，将其转化为易于气相色谱分析的化合物，如三氯化乙酰的脯氨酸酯。

通过测定峰面积或峰高来定量分析脯氨酸。

3. 毛细管电泳法（CE）：毛细管电泳是基于溶液中离子迁移速率的差异进行分离和测定的方法。

该方法可以通过测定脯氨酸的迁移时间或峰面积来定量分析脯氨酸。

4. 免疫测定法：免疫测定法是利用特异性抗体与脯氨酸结合，通过测定免疫复合物的形成量来定量分析脯氨酸。

常见的方法包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）和放射免疫测定法等。

需要注意的是，不同的测定方法具有不同的特点和适用范围，在选择方法时需要根据具体情况进行选择。

同时，还需要注意测定方法的准确性、灵敏度和重复性
等指标。

羟脯氨酸测定原理羟脯氨酸（Hydroxyproline）是一种非常重要的氨基酸，在胶原蛋白中占有重要地位。

羟脯氨酸的含量可以作为评估胶原蛋白合成和降解的指标，因此，羟脯氨酸的测定具有重要的临床意义。

本文将介绍羟脯氨酸测定的原理及其应用。

羟脯氨酸的测定原理主要基于其与酚类物质反应生成紫色化合物的特性。

一般情况下，羟脯氨酸的测定方法主要有两种：色素法和高效液相色谱法。

色素法是羟脯氨酸测定的常用方法之一。

其原理是在碱性条件下，羟脯氨酸与酚类试剂发生缩合反应，生成有色产物。

这种反应是一种氧化还原反应，需要存在氧化剂的存在，常用的氧化剂有次氯酸钠和过氧化氢。

在碱性条件下，羟脯氨酸与酚类试剂发生缩合反应，生成的产物可以通过分光光度计测定其吸光度，从而计算出羟脯氨酸的含量。

高效液相色谱法是羟脯氨酸测定的另一种常用方法。

该方法利用高效液相色谱仪对样品进行分析。

在该方法中，首先将样品中的羟脯氨酸与特定的试剂进行反应，生成具有荧光的产物。

然后，将反应产物注入高效液相色谱仪中进行分离和检测。

通过测定峰面积或峰高的方式，可以计算出羟脯氨酸的含量。

羟脯氨酸的测定方法在临床和科研领域有着广泛的应用。

在临床上，羟脯氨酸的测定可以用于评估胶原蛋白合成的情况，对于一些与胶原蛋白代谢相关的疾病的诊断和治疗具有重要意义。

此外，羟脯氨酸的测定方法还可以用于评估食物中胶原蛋白的含量，对于食品安全和质量控制也有一定的应用价值。

在科研领域，羟脯氨酸的测定方法可以用于胶原蛋白的合成和降解研究。

通过测定羟脯氨酸的含量，可以评估胶原蛋白的合成速率和降解速率，进而研究胶原蛋白的代谢机制。

此外，羟脯氨酸的测定方法还可以用于评估某些药物对胶原蛋白合成和降解的影响，为新药的研发提供参考依据。

总结起来，羟脯氨酸是一种重要的氨基酸，在胶原蛋白代谢中起着关键作用。

羟脯氨酸的测定可以通过色素法和高效液相色谱法等方法进行。

这些方法不仅在临床上有着重要的应用价值，还在科研领域中发挥着关键作用。