生物信息学
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以胰岛素为目标蛋白进行构建系统进化树,以土拨鼠的胰岛素为搜索的目标。先从用NCBI中找到土拨鼠的胰岛素氨基酸序列,然后运用BLAST工具比对,找到不同物种的同源序列,这包括直系同源物(ortholog)和旁系同源物(paralog),寻找的物种如下:
1、insulin [Cavia porcellus]
>gi|387059|gb|AAA37041.1| insulin [Cavia porcellus]
MALWMHLLTVLALLALWGPNTNQAFVSRHLCGSNLVETLYSVCQDDGFFYIPKDRRELEDPQVEQTELGMGLGAGGLQPLALEMALQKRGIVDQCCTGTCTRHQLQSYCN
2、preproinsulin [Meriones unguiculatus]
>gi|82749734|gb|ABB89751.1| preproinsulin [Meriones unguiculatus]
MALWMRLLPLLAFLILWEPTPAHAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKFRRGVEDPQMPQLELGGSPGAGDLQALALEVARQKRGIVEQCCTGICSLYQLENYCN
3、preproinsulin 1 [Rattus losea]
>gi|82749718|gb|ABB89743.1| preproinsulin 1 [Rattus losea]
MALWMRFLPLLALLVVWEPKPAQAFVKQHLCGPHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRREVEDPQVPQLELGGSPEAGDLQTLALEVARQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN
4、preproinsulin [Microtus kikuchii]
>gi|82749736|gb|ABB89752.1| preproinsulin [Microtus kikuchii]
MALWMRLLPLLALLVLWEPNPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRRGVEDPQVAQLELGGGPGAGDLQTLALEVAQQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN
5、Insulin [Cricetulus griseus]
>gi|344252373|gb|EGW08477.1| Insulin [Cricetulus griseus]
MTSQIRQNYSTEVEAVVTHLVNLHLWASYTYRSLGYYFDWDDMALVGVGHFFHKLTKACPLKFQNDCRGHALFQDVHKPSQDEWEAVEAALALKKDPNQALLDFYSLGSGHTGPHLCYFLEGYFLYEEVKLLICYCSIMALWMRLLPLLALLALWEPNPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRRGVEDPQVTQLELGGGPGAGDLQTLALEVAQQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN
6、Insulin [Heterocephalus glaber]
>gi|351712794|gb|EHB15713.1| Insulin [Heterocephalus glaber]
MALWMRLLAVLALLALWRPDTAQAFVNRHLCGSHLVEALYLVCGDNGFFYTPKERREENLQVGQAEPGMGLEAGGLQPLAQELALQKRGIVDQCCNSICSLYQLQNYCN
7、insulin [Octodon degus]
>gi|202472|gb|AAA40590.1| insulin [Octodon degus]
MAPWMHLLTVLALLALWGPNSVQAYSSQHLCGSNLVEALYMTCGRSGFYRPHDRRELEDLQVEQAELGLEAGGLQPSALEMILQKRGIVDQCCNNICTFNQLQNYCNVP
8、insulin [Octodontomys gliroides]
>gi|60672470|gb|AAX33341.1| insulin [Octodontomys gliroides]
YSSQHLCGSNLVEALYMTCGHNGFYRPNDGIVDQCCNNICTFNQLQNYCNVP
9、insulin [Ctenomys leucodon]
>gi|60672472|gb|AAX33342.1| insulin [Ctenomys leucodon]
YASQHLCGSHLVEALYMTCGHNGFYRPNDGIVDQCCNNICTFNQLQNYCNVP
10、preproinsulin 1 [Octodon degus]
>gi|82749720|gb|ABB89744.1| preproinsulin 1 [Apodemus semotus]
MALCVRFLSLLILLILWEPNPAQAFVKQHLCGPHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRREVEDPQVEQLELGGAPGTGDLETLALEVARQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN 其中1为土拨鼠的胰岛素的氨基酸序列、2为长爪砂鼠的前胰岛素原的氨基酸序列、3为罗赛鼠的前胰岛素原的氨基酸序列、4为台湾田鼠的前胰岛素原的氨基酸序列、5为灰仓鼠的胰岛素的氨基酸序列、6为裸鼢鼠的胰岛素的氨基酸序列、7为智力八齿鼠的胰岛素的氨基酸序列、8为八齿山鼠的胰岛素的氨基酸序列、9为白齿栉鼠的胰岛素的氨基酸序列、10为台湾森鼠的前胰岛素原的氨基酸序列。将每个物种的氨基酸序列以FSATA形式保存在txt文本文件中,序列只包含序列字母。
之后构建进化树,采用的软件是MEGA 5.0 ,MEGA 5.0 拥有phylogeny、User Tree、selection、rates、Clocks等多种功能,是一个图形化、集成的进化分析工具,比Blast、Clustal软件强,序列比对、进化树、进化数据矩阵的性能十分完美,能够完美的显示出进化树的图形。
构建系统进化树的具体步骤为:1、导入序列:打开MEGA 5.0软件,导入需要构建系统进化树的序列,点击界面中的“Align”按钮,点击“Edit/Build Alignment”选择“creat a new
alignment”选择构建蛋白质序列比对。点击“creat new data”再点击“insert sequence form file”选择刚刚保存的txt文件;2、序列比对分析:点击界面上的W,开始进行序列比对,点击“phylogentic analysis”然后保存文件为meg格式;3、系统进化树的构建:构建进化树的方法有距离依靠法(distance methods)和独立元素法(discrete character methods),距离依靠法是指进化树的拓扑形状由两两序列的进化距离决定的,进化树枝条的长度代表着进化距离,独立元素法是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的,独立元素法包括最大简约性法(Maximum Parsimony methods)和最大可能性法(Maximum Likelihood
methods);距离依靠法包括非加平均分组法法(UPGMA)和邻位相连法(Neighbor-joining)。具体操作为:点击phylogeny,选择构建进化树的方法,我采用的是利用遗传距离预测进化关系中的UPGMA方法,即非加权平均分组法,系统进化树的测试方法Test of Phylogeny,通常要选择Bootstrap method,也可以选择不进行测试;重复次数No. of bootstrap Replications—通常设定至少要大于100比较好,随机数种子可以自己随意设定,不会影响计算结果。一般选择500或1000,其中“test of phylogeny”即测试系统选择“Bootstrap method” 即自展值,是用来检验你所计算的进化树分支可信度的。简单地讲就是把序列的位点都重排,重排后的序列再用相同的办法构树,如果原来树的分枝在重排后构的树中也出现了,就给这个分枝打上一分,如果没出现就给0分,这样经过你给定的repetitions次(至少1000次)重排构树打分后,每个分枝就都得出分值,计算机会给你换算成bootstrap值。点击compute即可进行构建进化树的操作,稍微等一下就可以显示出进化树的image,点击image中的copy to clipbord即可将所得进化树粘贴在文本中,因此所得进化树为: gi|82749718|gb|ABB89743.1| preproinsulin 1 Rattus losea gi|82749720|gb|ABB89744.1| preproinsulin 1 Apodemus semotus gi|82749736|gb|ABB89752.1| preproinsulin Microtus kikuchii gi|344252373|gb|EGW08477.1| Insulin Cricetulus griseus gi|82749734|gb|ABB89751.1| preproinsulin Meriones unguiculatus gi|351712794|gb|EHB15713.1| Insulin Heterocephalus glaber gi|202472|gb|AAA40590.1| insulin Octodon degus gi|60672470|gb|AAX33341.1| insulin Octodontomys gliroides gi|60672472|gb|AAX33342.1| insulin Ctenomys leucodon gi|387059|gb|AAA37041.1| insulin Cavia porcellus8890656681100970.000.050.100.150.20
对于以上进化树节点的数值代表可信度,即那些数值是bootstrap值,代表物种(属)之间的种属相似度,数值越大,亲缘关系越近,枝长代表遗传距离。从得到的进化树仅胰岛素,罗赛鼠(Rattus losea)和台湾森鼠(Apodemus semotus)、台湾田鼠(Microtus kikuchii)和灰仓鼠(Cricetulus griseus)进化距离最近,接近90%,然后是八齿山鼠(Octodontomys gliroides)和白齿栉鼠(Ctenomys leucodon),其次是长爪砂鼠(Meriones unguiculatus)、智利八齿鼠(Octodon
degus),再是裸鼢鼠(Heterocephalus glaber),最后是土拨鼠(Cavia porcellus)进化距离比较远。罗赛鼠和台湾森鼠的外形有点相似:罗赛鼠体背毛黄褐色或棕褐色,腹部白色,腹毛尖端白色,基部灰色;台湾森鼠体背黑褐色,腹部灰白。可能正是这些相似的外形,它们的进化距离最近。台湾田鼠和灰仓鼠的臼齿可以不停的生长,以植物为食,生活习性相似,所以进化距离最近,亲缘关系接近;像其他的如八齿山鼠和白齿栉鼠,白齿鼠体型中小,毛发蓬松,它们特别善于打洞建立复杂的隧道系统,栉鼠会发出警报的声音;八齿鼠体型较小,它们善于构筑地道,社会性较强,它们之间会用17种不用的叫声进行对话,并且拥有旺盛的好奇心,它们可能也是具有这些相似的特征或生活习性,进化距离才比较近,亲缘关系也比较接近;长爪砂鼠、智利八齿鼠可能也是具有某些相似的特征和习性,进化距离才比较近,亲缘关系比较近;而裸鼢鼠是一种7.5厘米长的啮齿动物,是豪猪和豚鼠的“堂兄弟”,它能用巨大的门牙在坚硬的荒漠土壤中开凿出一条隧道,看上去身体完全是光秃秃的,且裸鼢鼠是哺乳类中唯一的真社会性动物,所以裸鼢鼠的进化距离比较远,与其它的亲缘关系较远;最后土拨鼠平均体重为4.5公斤,最大可成长至6.5公斤,身长约为56公分。土拨鼠主要分布于北美大草原至加拿大等地区,土拨鼠主要以素食为主,食物大多为蔬菜、苜蓿草、莴苣、苹果、豌豆、玉米及其它蔬果为主,一天最多可以吃上五公斤的绿色蔬果,更重要的是土拨鼠与松鼠、海狸、花栗鼠等皆属于啮齿目松鼠科,因此土拨鼠与其他的物种进化距离