下载文档原格式
小鼠骨髓基质细胞分化研究骨髓基质细胞是一种多能干细胞，可以分化成不同种类的细胞，包括肌肉细胞、神经细胞、心脏细胞和血管细胞等。
因此，骨髓基质细胞的研究具有重要的生物医学意义。
近年来，越来越多的研究表明，小鼠骨髓基质细胞分化具有很高的潜力。
其中最常见的方法是使用化学因子和基因转录因子诱导其分化成为目标细胞。
虽然这种方法效果不错，但是其安全性和稳定性还需要更多的研究验证。
相比之下，研究人员开始将更多的重点放在了寻找自然分化诱导因子上。
通过这种方法，可以尽可能地避免使用化学物质或者影响基因表达。
其中最有前途的是利用微环境因子诱导小鼠骨髓基质细胞分化。
微环境是指细胞周围的环境因素，包括细胞外基质、细胞间质和生长因子等。
这些因素可以影响细胞的行为和命运。
因此，微环境因素在维持正常生理和发展中具有非常重要的作用。
最近的研究表明，微环境对小鼠骨髓基质细胞分化有很大的影响。
可以通过调节细胞周围的硬度和生长因子浓度等参数，来控制骨髓基质细胞的分化。
例如，研究人员发现，通过将小鼠骨髓基质细胞培养在不同硬度的基质上，可以诱导它们分化成为肌肉细胞或者成骨细胞。
此外，通过使用生长因子重建细胞外基质，可以控制小鼠骨髓基质细胞分化为心肌细胞或者神经元细胞。
另外，最近的研究还显示，细菌内毒素可以诱导小鼠骨髓基质细胞分化为成骨细胞。
这种方法的优点是可以避免使用化学物质或者影响基因表达。
然而，其安全性和稳定性还需要更多的研究验证。
总的来说，小鼠骨髓基质细胞的分化研究具有非常重要的意义。
通过寻找自然分化诱导因子，可以尽可能地避免使用化学物质或者影响基因表达。
而微环境因素在这方面具有非常重要的作用。
未来的研究需要更加深入地探索这些微环境因素，并将其用于临床治疗。
骨髓基质干细胞成骨的研究进展组织工程技术是目前解决大块骨与软骨组织缺损修复难题最有前景的手腕之一，种子细胞是组织工程学中的重要环节。
骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，在体内外适当的诱导环境下能够分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、肌腱及韧带等多种组织细胞。
该细胞群来源充沛，取材方便，增殖能力强，可在体外大规模扩增而不丢失多向分化潜能，而且异体移植免疫排斥反映小，目前已成为应用较普遍的重要种子细胞之一。
本文就骨髓基质干细胞成骨问题进行论述。
1 骨髓基质干细胞的来源与获取骨髓基质干细胞可来源于机体各个部位骨髓。
人通常取自髂骨，兔取自股骨髁上。
对人而言，不同部位来源的BMSCs功能状态不一。
椎骨来源的BMSCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性低于股骨来源的BMSCs，而骨钙素mRNA的水平较后者高。
BMSCs的数量随着年龄的增加也不断减少，鼠在21个月时股骨干骨髓中的细胞要少于4个月时的骨髓细胞。
BMSCs在骨髓中含量极少(1×105个单核细胞中含有1个BMSCs)，因此要求在体外培育扩增后，才能达到组织工程学所要求的细胞数量。
在抽取骨髓血的进程中，每一个部位抽出量不该超过2 mL，不然将因抽出物中血量增加而引发有核细胞数的明显下降。
经常使用取得BMSCs的方式有：a)贴壁法。
所得细胞成份复杂，BMSCs的纯度不足；b)密度梯度离心法。
该方式基于沉降作用，这是较简便且有效的分离方式，它能有效地将红细胞、白细胞和间充质细胞分离开来。
Lisignoli［1］研究发觉，密度梯度离心法能增加BMSCs分化成为成骨细胞克隆的数量；c)流式细胞仪法；d)免疫学方式。
免疫选择法通过骨髓基质干细胞表面带有或缺乏某些抗原标志，进行挑选，可取得相对纯化的基质干细胞。
赵子义等［2］研究发觉，利用免疫磁珠标记神经生长因子受体(nerve growth factor receptor，NGFR)抗体分离、纯化而取得NGFR＋MSCs比一样培育条件下贴壁法纯化BMSCs其扩增倍数高出2～3个数量级，而且其内含有更高比例具有多向分化潜能的细胞，因此分离骨髓NGFR＋细胞取得的BMSCs作为种子细胞应用于组织工程具有明显优势。
细胞培养与细胞系的建立细胞培养是生命科学研究中必不可少的技术手段之一，它可以通过控制和维持细胞外环境，使细胞在体外生长和繁殖。
由于细胞培养技术可以在较短时间内得到大量的同种细胞，使得生物学和医学等领域的实验变得更加容易和方便。
而细胞系则是指由同一种细胞建立起来的一个细胞群体，是细胞生物学、分子生物学、药理学等领域里必不可少的研究对象。
一、细胞培养骨干技术1. 细胞培养的基本条件：细胞种类、培养基、培养条件（温度、CO2浓度、湿度、通气等）2. 细胞划分：原代细胞、细胞系、细胞株3. 细胞分离方法：酶消化、机械分离、胶质滤纸过滤、胶层分离、绒毛分离等4. 细胞凋亡与细胞健康状况监测：细胞膜容器渗透检测、Trypan蓝染色法、荧光染色等二、细胞系建立的过程1. 细胞培养条件的筛选：种类、培养基和培养条件2. 结合基因检测识别细胞：统一接种方法、培养期间生长速度的观察3. 细胞系的测定：细胞形态、DNA指纹技术、生物学/化学标记技术以及微镜下的观察三、细胞系的应用1. 细胞系的作用和意义：为生命科学研究提供常见、熟悉和稳定的实验平台2. 细胞系在生物学、分子科学、临床医学、肿瘤学、流行病学和毒理学等领域的应用3. 建立细胞系的意义：有效解决生命科学研究的问题，为人类健康提供保障细胞培养和细胞系建立是细胞生物学及其它相关工作的基础。
虽然细胞培养技术在不同领域的使用有着不同的需求和要求，但这种技术对生命科学的推进和人类健康的提高产生了极深的影响。
我们相信，随着科研工作的不断深化和发展，细胞培养和细胞系建立的技术也会不断地得到完善和发展，为人类的身体健康作出更大的贡献。
小鼠骨髓细胞群细胞系的建立
一、实验目的：
1) 通过培养小鼠骨髓基质细胞，建立小鼠骨髓基质细胞系 2) 了解细胞培养的一般步骤和注
意事项，培养无菌操作意识
二、实验原理：
细胞培养：多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞。
移植到体外后，只要条件适合，依然保持着分裂增殖的能力。利用这个原理,将小鼠骨髓基
质细胞移植到体外培养。通过一定的纯化方法，从原代细胞得到传代细胞，经过若干代中，
部分细胞发生遗传物质的变化成为无限传代的性质，分离得到细胞系。
培养细胞纯化：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞先脱壁，
利用此道理，采用多次差别消化法将上皮细胞核成纤维细胞分离而达到纯化的目的
三、材料：实验小白鼠
四、药剂及配制：
五、仪器器材：
（1）培养皿×3、500ml烧杯×1、棉花、医用解剖器材（剪刀、镊子、解剖刀）、10ml注
射器、4号针头、离心管若干、三角瓶若干、25ml卡式瓶若干、滴管、精密pH试纸、0.22
μm微孔滤膜、血球细胞计数板、标签纸、油性笔、冻存管 （2）超净工作台、CO2培养箱、
高速离心机、高压灭菌锅、显微镜、水浴锅、-86℃冰箱
2、无菌工作室及其内物品的消毒灭菌 （1）超净工作台
检查超净工作台是否正常；用之前用沾了75%酒精的脱脂棉擦拭，再开30min的紫外照射 （2）
小件物品
用牛皮纸（报纸）将小件物品(如镊子、解剖刀等)包裹好放进饭盒里，放进灭菌锅，其他物
品也一并放入蒸汽灭菌锅内，95KPa、121℃下灭菌30min （3）其他仪器灭菌 3、试剂配制
（如上表） 4、器材准备 5、注意：
1) 使用高压灭菌锅时注意正确使用方法，以免引起危险 2) 超净工作室和工作台必须清理干
净，以免引起细胞污染
浸泡
•用5%的盐酸溶液浸泡过夜
刷洗
•用足量的洗衣粉反复刷洗,将瓶壁上的残渍洗干净
浸酸
•将干燥后的器皿用重络酸钾溶液(重络酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水
1L)浸泡过夜
冲洗
•将浸酸后的玻璃器皿用自来水冲洗,然后用蒸馏水,最后干燥、待用
第二部分 原代培养
器材：解剖刀、剪刀、镊子、平皿、注射器、离心机、血球计数板、15ml离心管×4、培养
瓶×2，冰块
试剂：乙醚、D-Hank’s溶液、生理盐水 仪器：超净工作台、离心机、显微镜 步骤： 1.取
样
1) 超净工作台上的物品：灭菌后的解剖刀、剪刀、镊子、注射器、平皿、冰块 2) 将小鼠用
乙醚麻醉后引颈处死（用培养皿盛），在盛有75%酒精的烧杯中浸
泡5min。在超净工作台上分离双侧股骨（培养皿下置冰块），在含生理盐水的50mm2玻璃
平皿中去除股骨周围肌肉组织（皿下置冰块）。
3) 剪去骺端。用10mL注射器抽取食量D-Hank’s液冲洗骨髓腔，将骨髓冲入
培养瓶。
4) 用4号针头反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液,，盛在离心管里。 5) 将悬液在
1000r/min下离心5min后收集细胞 2.原代培养
1) 取出部分细胞用显微镜计数【附：血球计数板计数法】 2) 以1×108/ml细胞密度接种在
25cm2卡式瓶中，加血清培养基 3) 在饱和湿度下 5% CO2 37℃恒温培养箱中培养。 3、注意：
1) 超净工作台上操作的基本规范； 2) 离心机的使用方法；
第三部分 传代培养
器材：卡式瓶若干、滴管、洗耳球、移液管 试剂：D-Hank’s液、胰蛋白酶液、EDTA液 材
料：生长良好的原代培养细胞 步骤：
1、从培养箱中取出培养五天后的培养瓶，用滴管吸掉旧培养液
2、用D-Hank’s液洗涤细胞1或2次，洗去血清和活力弱的细胞【在培养瓶中滴加BSS，
直接倾倒，重复即可】
3、用胰蛋白酶-EDTA液（1:1）消化分散贴壁细胞【加入消化液，37℃，数分钟（看情况而
定，显微镜下细胞将要分离呈现圆粒状即可）】
4、加适量含血清的培养液终止消化作用，离心去上清液，加D-Hank’s液洗涤1-2次
5、轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入培养基，吹打混匀。按比例稀释后接种到新的培养
瓶中培养。
第四部分 纯化
器材及仪器：吸管、离心管、培养瓶、显微镜、离心机 试剂：培养基、胰蛋白酶液、EDTA
液 材料：生长良好的传代培养细胞 步骤：
1) 取出细胞培养瓶，用0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA液混合漂洗细胞，摇动，
用显微镜观察，等到差不多半数细胞脱落后，停止消化
2) 将消化液用吸管吸出到离心管中，离心去上清，沉淀的细胞转入新培养瓶中，
加培养液培养 3) 原瓶加液继续培养
注意：各步骤均在无菌工作室内进行
第五部分 冻存和复苏
试剂：培养基、20%DMSO、台盼蓝
器材：冻存管、血球计数板、离心管、试管、培养瓶、吸管 仪器：-86℃冰箱、离心机、显
微镜、水浴锅 步骤：
1. 离心用试管收集对数生长期的纯化培养细胞（如果不是，可更换培养瓶里的
培养基，培养24h），加血清培养基，重悬起细胞 2. 取0.1mL细胞计数，计算细胞浓度及冻
前存活率
3. 冻存液的配制：取离心管，加入血清培养基，逐滴加入DMSO至20%；用
前配制，待置室温下
4. 取冻存液缓慢逐滴加入细胞悬液中，边加变轻微摇动，至DMSO浓度成10%
止，细胞浓度1~5×106个/mL，混匀，分装到冻存管中，标记；留少量做污染检测
5. 冻存：先将冻存管置于4℃10min，调节冰箱，-20℃30min，-80℃18h；有条
件的可以将冻存管放到液氮槽中长期储存 6. 复苏：
1) 将取出的冻存管迅速投入37~40℃水浴中，振荡；
2) 将细胞液吸出到培养瓶中，加培养液离心洗涤1-2次，除去冻存保护剂； 3) 将培养液细
胞浓度调整到1×105-2×105个/mL，常规培养
注意事项：慢冻快苏原理；冻存管若是安培瓶或无螺帽冻存管，小心冻存管爆裂，若是非螺
旋盖冻存管，应注意防止水进入而造成污染
附1：细胞计数法
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即
可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作：
①盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
②制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到离心管中，加入5滴台盼蓝，活细胞不
会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 ③将细胞悬液滴入计数板：
将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，
注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
④统计4个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看
到镜中出现计数方格后，数出四角的4个大铬（每个大格含有16个中格）中没有被染液染
上色的细胞数目。
⑤计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： （细胞悬液的细胞数）/mL＝（4
个大格子细胞数/4)×2×104 说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘
以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1mL＝1000mm3 细胞计数要点：
①进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于1×107 L-1，如果细胞数目很少要进行离心
再悬浮于少量培养液中。
②要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
③取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，
以求计数准确。
④数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照1个细胞计算。如果细胞压
在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
⑤操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
初学者易犯的错误： 计数前未将待测悬液吹打均匀。滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。
