苹果轮纹病拮抗细菌T2、J4最优培养基的筛选
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第21卷 第1期 衡水学院学报 Vol. 21, No. 1 2019年2月 Journal of Hengshui University Feb. 2019
苹果轮纹病拮抗细菌T2、J4最优培养基的筛选 侯晓杰，梁魁景 （衡水学院 生命科学学院 河北 衡水 053000）
摘 要：采用平板对峙培养法，通过T2、J4细菌发酵上清液对苹果轮纹病菌丝生长的抑制作用实验，筛选了T2、J4细菌培养的最优培养基。结果表明：4号培养基（黄豆粉30 g、玉米粉30 g、NaCl 0.6 g）是T2细菌的最优培养基；1号培养基（蛋白胨6 g、酵母浸膏3 g）和2号培养基（蛋白胨3 g、牛肉浸膏1.8 g、葡萄糖1.5 g）是J4细菌的最优培养基。 关键词：T2细菌；J4细菌；苹果轮纹病；最优培养基 DOI：10.3969/j.issn.1673-2065.2019.01.003 作者简介：侯晓杰（1981－），女，河北武邑人，副教授，农学博士； 梁魁景（1983－），男，河北威县人，讲师。 基金项目：河北省高等学校青年拔尖人才计划资助项目（BJ201406） 中图分类号：S432.4 文献标识码：A 文章编号：1673-2065(2019)01-0010-03 收稿日期：2018-05-24
苹果轮纹病（Apple ring rot），由贝氏葡萄座腔菌梨专化型引起苹果果实腐烂、枝干树皮疣突及局部坏死的真菌病害，又称疣皮病或粗皮病[1]。在中国大部分地区均有发现，已经成为苹果生产和储存中最严重的病害之一，其主要发病地区为中国中部高温多雨地区，在多雨季节尤为严重[2]，严重影响了我国苹果
的生产和储存，给果木业带来了巨大的经济损失。目前，在苹果轮纹病的防治方面主要采用的是新兴技术与传统技术相结合的方法[3]。新兴的生物防治技术虽然取得一定成果但由于技术、经济问题的限制并未大规模推广应用，传统防治技术依旧是苹果轮纹病的主要的防治技术，而传统防治技术以加强栽培管理、刮治病斑及化学药剂防治等传统的物理、化学防治为主，这种防治方法在防治过程中会使树势衰弱，抗病能力下降，药剂残留，危害人体健康，造成环境污染，严重影响可持续发展。 在植物的根际有很多不同的微生物，T2即是健康苹果树根际土壤细菌中的一种。大多数的根际微生物能够促进植物的生长和健康存活，并且不会对植物造成损害。健康苹果树根际土壤中的细菌对于苹果树树势及产量的提高、果实品质的提升等都有着积极的作用。J4是从姜组织内分离出的内生细菌，前期实验研究证明它们对苹果轮纹病菌具有较好的抑制作用。 本次实验将对T2、J4最优培养条件进行筛选研究[4]，而不同的培养条件会影响内生细菌的分裂数量。笔者对培养基成分及配比、培养温度、培养时间等培养条件进行优化组合，以获得更多的分裂数量。通过对T2、J4细菌培养条件的研究，找到高效的细菌菌体及代谢物产生的培养条件，从而为苹果轮纹病的生物防治奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 健康苹果（超市购买）、土豆（菜市场购买）、酵母浸膏、牛肉浸膏、葡萄糖、黄豆粉、马铃薯淀粉、玉米粉、J4内生细菌（衡水学院生命科学系微生物实验室保存）、T2细菌（衡水学院生命科学系微生物实验室保存）、苹果轮纹病菌（衡水学院生命科学系微生物实验室保存）、PDA培养基（马铃薯 200 g、葡萄糖20 g、琼脂条10 g、自来水1 L）、营养琼脂培养基（营养琼脂粉4.2 g、自来水 100 mL）。 第1期 侯晓杰，等 苹果轮纹病拮抗细菌T2、J4最优培养基的筛选 11 1.2 方法 1.2.1 4种供试培养基的配制 4种细菌发酵培养基配方见表1。 表1 细菌发酵培养基配方 培养基编号 蛋白胨/g 酵母浸膏/g 牛肉浸膏/g 葡萄糖/g 黄豆粉/g 马铃薯淀粉/g 玉米粉/g NaCl/g 1 6 3 0 0 0 0 0 0 2 3 0 1.8 1.5 0 0 0 0 3 0 0 0 0 15 6 0 0.6 4 0 0 0 0 30 0 30 0.6
根据上述培养基配方配制4种不同培养基，121 ℃高压灭菌15 min备用。 1.2.2 细菌发酵液的制备 菌悬液的制备：用接种环分别划取培养皿中的T2、J4细菌菌体放入装有无菌水的三角瓶中，用漩涡振荡器震荡均匀备用。 722N可见分光光度计的调试：将3 mL蒸馏水放入比色皿中，放入分光光度计，调100%，吸光度为0.000。 将震荡好的T2、J4菌悬液用移液器（注意更换枪头）吸取3 mL放入2个比色皿中，将其放入分光光度计中，测其OD值，将T2、J4菌悬液的吸光度稀释到相同（吸光度：1.9），将吸光度相同的T2、J4菌悬液放入4种培养基中。每种培养皿放1 mL菌悬液。将接种好的培养基放入摇床中震荡培养（30 ℃, 60 h, 160 r/min）。 1.2.3 各培养基发酵液对苹果轮纹病菌丝的抑菌活性测定 采用平板对峙法：将摇床中T2、J4菌悬液取出，用称量器称量包含离心管及盖的重量共计47 g。将称量好的离心管及菌悬液放入离心机中离心（离心机内应对称放置），温度4 ℃ 10 000 r/min，15 min进行离心。将离心好的上清液放入三角瓶中，用灭菌锅进行灭菌。将T2、J4上清液吸取5 mL放入降温至48 ℃ PDA培养基中混匀，倒入培养皿中。用打孔器打8 mm的苹果轮纹病菌饼，接种到平板中，放入培养箱中（28 ℃）培养，观察并测量直径。 1.3 数据处理 用Excel软件对数据进行处理，用SPSS16.0软件进行方差分析，差异显著性水平为5%（p≤0.05）。 2 结果与分析 2.1 J4不同培养基发酵液对苹果轮纹病菌丝的抑制作用 通过测量苹果轮纹病菌菌块生长大小来探究不同培养基的J4发酵液对苹果轮纹病的抑制作用。苹果轮纹病菌块生长越小表明J4发酵液对苹果轮纹病菌的抑制作用越强，即这种培养基越适合J4的生长。 7 d后观察苹果轮纹病的生长情况，实验结果如表2所示。 由表2可知：不同种培养基的J4发酵液对苹果轮纹病菌丝都具有抑制作用。与对照比较，3号培养基和4号培养基抑制效果差异不显著，1号，2号抑制效果差异显著；而不同培养基之间进行比较，1号与2号培养基抑制效果差异不显著。所以1号，2号培养基是J4的最优培养基。 2.2 T2不同培养基发酵液对苹果轮纹病的抑制作用 通过测量苹果轮纹病菌菌块生长大小来探究不同培养基的T2发酵液对苹果轮纹病的抑制作用。7 d后观察微生
表2 J4细菌发酵上清液对苹果轮纹病的抑菌结果 培养基编号 轮纹病菌落直径/cm 重复1 重复2 重复3 平均值 1 6.7 8 5.6 6.8b 2 6.1 5.9 7 6.3b 3 7.7 7.7 7.7 7.7a 4 7.6 6.9 6.9 7.1ab 对照 7.8 8.4 7.5 7.9a 12 衡水学院学报投稿平台:http://hssz.cbpt.cnki.net/ 第21卷 物的生长状况发现：不同培养基的T2发酵液对苹果轮纹病的抑制作用是不同的。用Excel软件对数据进行处理，用SPSS16.0进行方差分析，差异显著性水平为5%（p≤0.05），结果如表3所示。 由表3可知：不同种培养基的T2发酵液对苹果轮纹病菌丝都具有抑制作用。与对照比较，1号、2号和3号培养基抑制效果差异不显著，4号培养基与对照具有显著差异性。不同培养基之间进行比较，4号培养基与1号、3号差异不显著，与2号培养基差异显著，所以4号培养基是T2的最优培养基。 3 结论与讨论 通过平板对峙试验表明，1号、2号培养基是J4细菌培养的最优培养基。4号培养基是T2细菌培养的最优培养基。这为T2、J4细菌更为广泛的应用于农业生产与储存中苹果轮纹病的防治提供了理论基础。 通过本次实验，研究筛选了T2、J4细菌的最优培养基，但是由于培养基的种类较少，且尚未研究不同的环境条件（温度、pH值、时间等）对T2、J4细菌培养效果的影响。所以筛选结果具有一定的局限性。 当今社会农作物的生产与储存仍然存在着巨大的威胁，施加化肥农药是我国面对农业生产和储存采用的主要方式方法，但是长期使用化学药剂一方面会导致病原菌抗药性的产生使防治和增产的效果减弱，另一方面用药量不断地加大导致化学物残留较多并能够威胁人类健康。目前物理防治方法只是简单的预防，防治结果治标不治本，生物防治作为防治农作物病虫害的最优方式，细菌作为生物防治的主要应用来源逐渐得到人们的关注，但由于技术和经济原因并未大规模投入生产中，所以寻找经济、有效的生物防治方法已成为当前农作物防治病虫害的主要方法，寻找细菌的最优培养基成为其广泛应用的必要条件，并具有广阔的市场前景。
参考文献： [1] 徐成楠,周宗山,吴玉星,等.苹果轮纹病菌DNA提取方法研究[J].江苏农业科学,2009(1):45-46. [2] 王美琴,陈俊美,薛丽,等.番茄内生拮抗细菌的分离鉴定及最优培养条件研究[J].中国生态农业学报,2008,16(2):441-445. [3] LI guangxu, SHEN yongbo. Study on the infection mechanism of apple ring rot disease[J]. Journal of fruit trees, 2007,24(1):16-20. [4] 邓振山,赵龙飞,王薇薇,等.银杏内生真菌的分离及其对苹果腐烂病病原菌的拮抗作用[J].西北植物学报,2009, 29(3):608-613.
Screening of Optimal Medium for T2 and J4 Antagonistic Bacteria against Apple Ring Disease
HOU Xiaojie，LIANG Kuijing (College of Life Science, Hengshui University, Hengshui, Hebei 053000, China) Abstract: The optimal medium for T2 and J4 bacterial culture is screened by using the plate confrontation culture method to inhibit the growth of apple ringworm mycelium with T2 and J4 bacterial fermentation supernatants. The results show that: No. 4 medium (30g of soy flour, 30g of corn flour, 0.6g of Nacl) is the best medium for T2 bacteria; medium No. 1 (6g of peptone, 3g of yeast extract ) and No. 2 medium (3g of peptone, 1.8g of beef extract, 1.5g of glucose) are the optimal media for J4 bacteria. Key words: T2 bacteria; J4 bacteria; the apple ring disease; the optimal medium （责任编校：李建明 英文校对：李玉玲）
