1 项目一 酵母的固定化制备及应用
—实训过程图
组 别：第2组
班 级：生物制药1311
组 员：张婉月 徐洁 严梦迎 臧赢 陈孝颜
指导老师：彭加平 韦平和
实训过程：
1．制备固定化酵母细胞
（1）酵母细胞的活化： 1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
称取酵母 加入蒸馏水 静置活化
（2）配制CaCl2溶液：配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液
0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用。
称取氯化钙 cacl2溶液
（3）配制海藻酸钠溶液：称取0.7g海藻酸＋适量水→50mL烧杯→水浴锅
2 80℃（或间断）加热，并不断搅拌防止海藻酸钠焦糊，使之溶化
称取海藻酸钠 溶解海藻酸钠
（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合：将海藻酸钠溶液冷却至室温→加入活化酵母细胞→充分搅拌→转移至注射器中。
混合溶液 混合后的溶液
（5）固定化酵母细胞：以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠，凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。
2．固定化酵母细胞的发酵
3 （6）冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗2～3次。
冲洗
（7）发酵：150mL10％葡萄糖＋固定化酵母细胞→200mL锤形瓶→密封→25℃发酵24h。
称取葡萄糖 葡萄糖置于三角瓶中
加入蒸馏水 固定化酵母细胞置于葡萄糖溶液中
酵母细胞的固定化技术
学习目标：
1.简述固定化酶、固定化细胞的应用、原理和意义；
2.说出制备固定化酶、固定化细胞的一般方法；
3.尝试用包埋法制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行发酵。
课前导学：
一、固定化酶技术的应用
1．固定化酶：是指用物理学或化学的方法将___________与_______________结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。
2. 制备固定化酶的方法主要有：______________、交联法、______________等。
二、固定化细胞技术
1．固定化细胞：通过各种方法将________与_________结合，使细胞仍保持原有的生物活性。
2. 固定化细胞的方法：吸附法和 两大类。
3．直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点比较
类 型 优 点 不 足
直接使用酶 催化效率高，低耗能、低污染等。 对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，不易分离，可能影响产品质量。
固定化酶 酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。 一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。
固定化细胞 成本低，操作更容易。 固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降等。
三、实验操作程序
(一)制备固定化酵母细胞
1．活化酵母细胞：活化就是处于________状态的微生物重新恢复正常的生活状态。
2．配制CaCl2溶液：
3．配制海藻酸钠溶液：溶解海藻酸钠，最好采用酒精灯 的方法，直至海藻酸钠完全融化。如果加热太快，海藻酸钠会发生 。
4．海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合：一定要将溶化好的海藻酸钠溶液________，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器。
实验二 酵母细胞固定化及乙醇发酵
一、 实验目的要求
1、 掌握微生物细胞固定化的原理和基本技术
2、 学习酵母乙醇发酵过程
二、 实验原理
（一） 固定化细胞（immobilized cell ）
固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催 化活性、反复使用的方法。近十余年来生物工程研究的重点领域之一；固定化细胞与固定化酶技术 一起组成了现代的固定化生物催化剂技术。
优点：细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、可反复使用、能实现连续
操作，可大大提高生产能力。
应用：已涉及到食品、化学、医药、化学分析、环境保护、能源开发等领域。用于生产各种
胞外产物，包括酒精酒类、氨基酸、有机酸、酶、辅酶、抗生素、甾体转化、废水处理；用于制造 微生物传感器
（二） 制备方法：吸附法；包埋法；共价结合法；交联法；
1、 吸附法：又叫载体结合法，依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附力 的作用，使细胞固定在载体表面和内部；
简便，活力损失小；但细胞与载体作用力小，易脱落
2、 包埋法：分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。
凝胶包埋法是将细胞包埋在各种凝胶内部的微孔中而使细胞固定；
半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内。
简单，条件温和，稳定性好，包埋细胞容量高。
3、共价结合法：细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，
从而形成为固定化细胞。
细胞与载体结合紧密，不易脱落；但制备较难，且活力损失较大。
4、 交联法：利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团（如氨基酸、羟基、咪唑 基等）发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键。
此法制备麻烦，活力损失较大；但细胞与载体结合较紧。
（三）载体
多糖类：纤维素、琼脂、葡萄糖凝胶、藻酸钙、K-角叉胶、DEAE-纤维素等
蛋白质：骨胶原、明胶等
1 实验一 固定化酵母酒精发酵
一、实验目的
掌握制备固定化细胞中最基本、最常用的方法。
掌握固定化酵母酒精发酵工艺。
掌握酒精的提取及测定方法。
二、实验原理
固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使酶和微生物活性不变。
一般胞内酶、提纯酶在固定化中或固定化后常不稳定，而固定化微生物不仅可避免复杂的酶提取和纯化过程，同时解决了酶的不稳定性问题。细胞固定化后，酶活较高，操作稳定性较好，可在多步酶促反应中应用并便于连续化、自动化操作。若代谢底物及产物均为低分子物质时使用固定化微生物细胞效果更佳。
微生物细胞固定化常用载体有：1、多糖类（纤维素、琼脂、葡聚糖凝胶、藻酸钙、K一角叉胶、DEAE-纤维素等）；2、蛋白质（骨胶原、明胶等）；3、无机载体（氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等 ）；4、合成载体（聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等）。选择载体原则以价廉、无毒、强度高为好。微生物细胞固定化常用的方法有三大类：
1．吸附法 2 吸附法是将细胞直接吸附于惰性载体上，分物理吸附法与离子结合法。（1）物理吸附法是利用硅藻土、多孔砖、木屑等作为载体，将微生物细胞吸附住。（2）离子结合法是利用微生物细胞表面的静电荷在适当条件下可以和离子交换树脂进行离子结合和吸附制成固定化细胞。吸附法优点是：操作简便、载体可再生；缺点是：细胞与载体的结合力弱、pH、离子强度等外界条件的变化都可以造成细胞的解吸而从载体上脱落。
2．包埋法
是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不至漏出而废物和产物可以进入和渗出。细胞和载体不起任何结合反应．细胞处于最佳生理状态。因此，酶的稳定性高，活力持久，所以目前对于微生物细胞的固定化大多采用包埋法。本次实验作为重点训练。
