发酵复习

1 发酵工程期末复习

第一章

1、发酵的定义（P1）

传统概念：发酵是在厌氧条件下，糖在酵母菌等生物细胞的作用下进行分解代谢，向菌体提供能量，从而得到产物酒精和CO2的过程。

对生物化学家来讲，发酵的定义是指微生物在无氧条件下分解代谢有机物质释放能量的过程。

现代概念：生物学家把利用微生物在有氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程称为发酵。

2、发酵工程的概念（P1）

发酵工程是利用微生物特定的性状和功能，通过现代工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系，是将传统发酵技术与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发酵技术。

3、发酵工程反应过程的特点

（1）由于采用生物催化剂，反应过程在常温常压下进行，且可运用DNA重组技术及原生质体融合等现代生物技术组建或改造生物催化剂而赋于生物反应过程以现实和潜在的活力，但生物催化剂易于失活，易受环境的影响和杂菌的污染，一般不能长时间使用。

（2）以采用可再生资源为主要原材料，来源丰富．价格低廉，过程中废物的危害性较小，但原料成分往往难以控制，给产品质量带来一定影响。

（3）与化工生产相比，生产设备较为简单，能量消耗一般也较少，但由于过高的底物或产物浓度常导致酶的抑制或细胞不能耐受如此高的渗透压而失活，因此反应液中的底物（基质）浓度不能过高，因此导致很大的反应器体积且要求在无杂菌污染情况下进行操作。

（4）酶反应过程的专一性强，转化率高，但成本较高，发酵过程成本低，应用广，但反应机理复杂，较难控制，反应液中杂质较多，给提取纯化带来困难。

4、发酵工程主要产品（P3-7）

酿酒、发酵食品、有机酸、醇及有机溶剂、酶制剂、氨基酸、核酸类物质、抗生素、生理活性物质、微生物菌体产品、生物农药及生物增产剂、生物能、环境净化、微生物冶炼、转基因产品等。

5、发酵工程的发展简史（了解）（P7-12）

传统发酵时期：酿酒制醋

近代发酵工程时期：

1680年荷兰人吕霍克（Leenwenhoek）制成了显微镜，人们才知道微生物的存在，

1857年法国著名生物学家巴斯德（Pasteur）用实验证明了酒精发酵是由活的酵母引起的，其它不同的发酵产物则由不同微生物的作用而形成。

1897年德国的毕希纳（Buchner）进一步发现磨碎了的酵母仍能使糖发酵而形成酒精。并将此具有发酵能力的物质称为酶。这样发酵现象的真相才开始被人了解。

从l9世纪末到20世纪30年代，不少工业发酵过程陆续出现，开创了工业微生物的新世纪。

近代生物技术产品开始出现于本世纪40年代。1928年由英国弗莱明发现而在1940年由弗洛里及钱恩等所提取经临床证实具有卓越疗效和低毒的青霉素抱着极大的希望。1941年美国和英国合作对青霉素进行进一步的研究和开发。不久，链霉素、金霉素、新霉素等相继问世。抗生素工业的兴起，标志着工业微生物的生产进入了一个新的阶段

现代发酵工程时期：

这一代生物技术产品的特点是运用了现代生物技术——DNA重组技术、细胞融合技术等的成果而进行生产的产品。 2 1953年美国的华生（watson）及科里克（Crick）发现了DNA的双螺旋结构，为DNA的重组奠定了基础。

1974年美国的波依耳（Boyer）和科恩（Cohen）首次在实验室中实现了基因转移，为基因工程启开了通向现实的大门，而使人们有可能在实验室中组建按人们意志设计出来的新的生命体。

所谓基因工程是按人的意志把外源（目标）基因（特定的DNA片段）在体外与载体DNA〈质粒、嗜菌体等〉嵌合后导入宿主细胞，使之形成能复制和表达外源基因的克隆（Clone——无性繁殖系或重组体），这样我们就可以通过这些重组体的培养而获得所需要的目标产品。

1975午英国的科勒及米尔斯坦发明了杂交瘤技术，它们的产品是单克隆抗体（MAb），可用作临床诊断试剂或生化治疗剂，这是一大类现代生物技术产品。

原生质体（去除细胞壁后的细胞体）融合技术可用于分类学中亲缘较远的生物体细胞之间的杂交，这对农作物品及牲畜品种的改良具有巨大的潜力。当然它也适用于工业微生物的性能改良。

1953年，格罗勃霍佛及希利兹即提出了酶的固定化技术，但其实用仅是最近几十年的事。

目前，用于基因工程的宿主除了大肠杆菌、枯草杆菌、酵母等微生物外，还对某些动物细胞抱有兴趣，虽然动物细胞培养要比微生物培养复杂得多。这是因为以微生物为宿主而获得的目标产物，虽然其蛋白质中的氨基酸顺序是正确的，但常因其蛋白质立体结构有误而不具活性，需要通过重折叠后才能获得目标产物。而由动物细胞进行表达时所获目标产物不存在上述缺点，为此基因工程推动了动物细胞培养技术的发展。

植物细胞的大规模培养历史早于动物细胞，利用植物细胞培养可以生产某些稀贵植物次生代谢产物。如生物碱、甾体化合物等，这也是属于现代生物技术范围内的产品。现代生物技术产品虽不多，但其潜力很大。

6、发酵工程菌种的特点（P14）

（1）能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，产量高；（2）可以在易于控制的培养条件下迅速生长发酵，且所需的酶活力高；（3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短；（4）根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株；（5）选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染噬菌体；（6）菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品品质的稳定性；（7）菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。

7、发酵类型（P25-34）

液体发酵和固体发酵：液体发酵是指将微生物接种到液体培养基进行的培养的过程；固体发酵也称固体培养或固态发酵，就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。

厌氧发酵和好氧发酵：厌氧发酵也称静止发酵，是利用一些厌氧微生物进行发酵，如丙酮、丁醇、乳酸、乙酸的生产；好氧发酵是利用需氧的微生物进行的发酵。

分批发酵和连续发酵：分批发酵是指将所有的物料一次加入发酵罐，然后灭菌、接种、培养，最后将整个罐的内容物放出，进行产物回收，清罐结束后，重新开始新的装料发酵的发酵方式；连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养液，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵培养方式。

第二章

1、菌种分离的一般过程：土样的采取→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定

2、选择性分离方法（P49）的五个步骤：含微生物材料的选择、材料的预处理、所需菌种的分离、菌种的培养、菌种的选择和纯化

3、 富集液体培养（P50）

要点：在混合菌群中提供有利于目的菌株的生长条件或不利于其他菌的生长条件

关键：控制移种时间

方法：底物、pH条件、培养时间、培养温度、培养手段（固体、液体、分批、连续）

4、自然选育与诱变育种（P54）：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，选育出优良 3 菌种的过程叫做自然选育；诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后利用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目标的突变株用于生产研究。

5、常见的各类诱变剂（P55）

物理诱变剂：紫外线、快中子、X射线、β射线、γ射线、激光

化学诱变剂：碱基类似物（2-氨基嘌呤，5-溴尿嘧啶，8-氮鸟嘌呤）、与碱基反应的物质（亚硝基胍NTG，亚硝酸NA，氮芥NM等）、DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基（吖啶类物质）

生物诱变剂：噬菌体、转座子

6、诱变育种的基本方法（P55）

出发菌株的选择（出发菌株的来源P55）、制备菌悬液、诱变处理、突变菌株的筛选

7、诱变育种工作中几个应注意的问题

（1）选择好出发菌株：选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。有些微生物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用强。如果用这种菌株于生产是很有益的，而用作出发菌株则不适宜。用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生理等方面有相当了解。挑选出发菌株的标准是产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广，再确定诱变剂的使用及筛选条件。

（2）复合诱变因素的使用：在微生物诱变育种中，可利用各种物理、化学诱变因素来处理菌种。对野分型菌株单诱变因素有时也能取得好的效果，但对老菌种单一诱变因素重复使用突变的效果不高，这时可利用复合因素来扩大诱变幅度，提高诱变效果。

（3）剂量选择：各种诱变因素有它们各自的诱变剂量单位，如紫外线剂量单位用焦耳，x一射线剂量单位是库（仑）每千克，中子剂量单位是戈。化学诱变因素一般是以溶液浓度来计算剂量单位的。对不同微生物使用的剂量是不同的，致死率取决于诱变剂量，而致死率和变异率之间有一定关系。因此可以用致死率作为选择适宜剂量的依据。

（4）变异菌株的筛选：诱变育种工作的一个主要任务是获得高产变异菌株。从经诱变的大量个体中挑选优良菌种不是一件容易的事。因为不同的菌种表现的变异形式是不同的，一个菌种的变异规律去发现那些与产量有关的特性，并根据这些特性，分门别类地挑选一定数最的典型菌株进行发酵和鉴定，以确定各种类型与产量之间的关系。这样，可大大提高筛选的工作效率。

（5）高产菌株的获得需要筛选条件的配合：在诱变育种过程中高产菌株的获得还必须有合适的筛选条件的配合，如果忽视这一点，则变异后的高产菌株不可能被挑选出来。

诱变与筛选可以说是一个问题的两个方面，必须用辩证的观点来看待。只重视诱变而忽视筛选，或过份重视菌种而忽视发酵条件的观点都是片面的，这样会影响高产菌株的获得。总之，在诱变育种过程中要正确处理出发菌株，诱变因素和筛选条件三者的关系。全面辩证地考虑上述三者之间的关系，将是诱变育种能否获得理想效果的重要关键。

8、原生质体融合（P59）

原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦可称“细胞融合”。

9、菌种保藏的原理

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。

10、菌种保藏方法（P67-69）

蒸馏水悬浮法、斜面传代保藏、矿物油中浸没保藏、干燥载体保藏、冷冻保藏（普通冷冻，超低温冷冻，液氮冷冻）、真空冻干保藏、寄主保藏、基因工程菌的保藏。

11、发酵工业生产过程中种子必须满足的条件（P70）

（1）菌种细胞生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；（2）生理性状稳定；（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（4）无杂菌污染；（5）保持稳定的生产能力。

12、种子质量的控制（P72-73）