基因工程 公开课(共11张PPT)

Figure 1
This figure is purely diagrammatic. The two ribbons symbolize the two phophate-sugar chains, and the horizonal rods the pairs of bases holding the chains together. The vertical line marks the fibre axis.
❖基因表达调控研究
基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育 过程中生物遗传信息的表达按一定时序发生变化（时序调节） ，并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。
原核生物的基因组和染色体结构都比较简单，转录和翻译在同 一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。
真核生物转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转 录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以 发生在各种不同的水平上。其基因表达调控主要表现在信号传 导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。
2021/7/23
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注：文档资料素材和资料部分来
广义上，分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大 分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生 命现象和生物规律，但目前主要研究基因的结构与 功能、复制、转录、表达和调控，确切地应称为分 子遗传学。
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第一节 引 言
DNA
mRNA
16S rRNA
tRNA
生物 大分子
蜘蛛毒素 金属硫蛋白
第三节 分子生物学的研究内容 ❖分子生物学的研究内容：
DNA重组技术 基因表达调控研究 结构分子生物学 基因组、功能基因组与生物信息学研究

粘粒载体有更大的容量
cosmid：由质粒与噬菌体 COS 末端组成，可克 隆 29-4组序列的克隆 包装后通过感染途径进入细胞 在细胞内可形成环状质粒，并作为质粒复制
缺陷： 外源 DNA 不稳定，易发生重排并丢失 插入片段长度对扩增效率影响极大
RNase H DNA polymerase
目前常用的逆转录酶 RNase H 均缺失 逆转录酶需要引物，一般用 Oligo-dT
五、末端脱氧核苷酸转移酶
Terminal deoxynucleotidyl transferase 催化脱氧核糖核苷酸依次添加到 DNA 3,羟基端 聚合反应没有特异性，无需模板 用途：
常用λ噬菌体有哪些种类？
EMBL 3：置换型载体 克隆片段长度：7－22 kb Spi 筛选，野生型在含 P2 噬菌体的宿主中受限
λgt 10：插入型载体， 克隆片段长度： 0－7.6 kb 片段 CI 筛选，野生型载体易进入溶源生长状态
λgt 11：插入型载体 克隆片段长度： 0－7.2 kb 片段 LacZ基因插入失活
一、什么是质粒载体？
质粒(Plasmid) 细菌染色体外的遗传单位 小分子环状 DNA
具有自身的复制起点 具有抗药性基因 人工构建的多克隆位点
复制子决定了质粒拷贝数
复制起点与调节序列共同组成复制子 严紧型复制子：
复制需 pol III，与细菌基因组复制同步 拷贝数：1－5 质粒/细胞 松弛型复制子： 复制需 pol I，独立复制 拷贝数：10－200 质粒/细胞 Rop 基因突变使质粒达到数千拷贝
一、限制性内切酶是切割 DNA 的工具
Restriction enzyme or restriction endonuclease 细菌产生的酶，能特异性识别 DNA 序列，水解 磷酸二酯键，切开 DNA 双链 它是细菌的一种防御机制

•
具有若干限制性内切酶单一识别
制的双链环状 DNA 分子。
位点，便于外源基因插入。
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克隆载体: PBR322
特点： • 分子量小，，便于操作。 • 有两个抗性基因，便于转化子筛选。 • 有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位
于四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入 将破坏抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用 于区分重组和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合 成停止时，它仍能继续复制。
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• 克隆载体(cloning vector)
用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低 的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒 或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建 （PBR322）。
• 表达载体(expression vector)
使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体 DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、 转录和翻译（pCDNA3）。
The Nobel Prize in Chemistry 1980
Jackson, Symons,and Berg (1972) – generated first recombinant DNA molecules
Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA
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ＣＣＴＴＣＡ
探针
１、核酸分子杂交的基本原理
① 基本原理： 碱基互补原则 ② DNA 的变性与复性
变性 导致 DNA 两条链之间的氢键 断裂，而核酸分子中的所有共 价键不受影响，称为DNA变性。
复性 去除DNA变性因素，两条DNA 链
重新结合成DNA双螺旋结构， 称
２、核酸分子杂交的基本方法
类型
待测核酸片段 探针
基因工程的优越性
1、可在亲缘关系极远的生物之间 进行，能大幅度地改变生物遗 传特性
2、能定向地改变生物遗传特性 3、能快速和稳定地获得新品种
二、基因工程的主要工作
（一）工具酶 （二）载体 （三）主要工作
（一）工具酶
类型
限制酶 修饰酶
1、限制酶
（restriction enzyme）
全称： 限制性内切核酸酶 功能： 识别双链 DNA 内部特异部位
杂交
X底片
Southern 杂交法
（二）核酸的体外扩增
（polymerase chain reaction , PCR）
聚合酶链反应技术
1、目的 在体外快速精确扩增基因组 DNA 2、原理 碱基互补原则， DNA复制 3、优点 ：
① 反应体系相对简单 ② 准确性高 ③ 时间短
4、基本过程
通过改变温度引起的重复进行 DNA 复制 的过程 ① 变性： 95ºC 左右 ② 退火： 引物 Tm 值 ③ 延伸： 70ºC 左右
裂解磷酸二酯键 来源： 原核生物细胞中分离
限制酶特点：
① 具有识别专一性和特异性（4—6个 bp ） 如：EcoRⅠ 5´-- G A A T T C -- 3´
BamHⅠ 5´-- G G A T C C -- 3´ HindⅢ 5´-- A A G C T T -- 3´ ② 具有特定的酶切位点 ③ 切交割错方切式割