酶工程

酶工程 1 酶工程：是将酶，细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物崔化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用的物质并将用于社会生活的一门科学技术。 2酶的转换数:又称分子活性或摩尔活性，表示单位时间内，酶分子中每个活性中心，或每个酶分子所能转换的底物的分子数。 3操纵子：是基因表达的协调单位，有调节基因，启动子，操纵基因和结构基因构成的一个完整的基因表达单位，其功能是转录MRMA. 4水活性：在一定的温度与压力下，反应体系中的水的蒸汽压与同样状态下纯水蒸汽压的比值。（ppt的定义：在一定的温度与压力的条件下，反应体系中的水的摩尔分数Xw与水活性系数Rw的乘积。 5 酶的固定：用物理或化学的方法定位在限定的空间区域，并能使其保持催化活性，可重复利用酶。 6 酶的修饰：通过各种方法可使酶分子的结构发生某些变化，从而改变酶的某些特性和功能的技术的过程。 7 反胶束:表面活性剂分子在非极性溶剂中自发形成的聚集体，表面的活性剂分子极性一端朝内，而非极性一端朝外与有机溶剂接触。 8 PH记忆：有机溶剂中的酶能保持其冷冻干燥前或沉淀前所在缓冲溶剂的PH. 9 酶的体外定向进化：利用基因工程的手段对酶的蛋白质分子进行改造，以期得到性质和功能更加完美的蛋白质分子。 10 核酶：是具有生物催化功能的核酸，它的化学本质是核酸，但同时具有酶的特异的催化作用。 11抗原：是指能够刺激机体产生（特异）免疫应答，并能与免疫应答物产生抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫反应（特异反应）。 12 抗原：是高等动物在抗原物质的刺激下，有浆细胞产生的一类能与相应抗原在体外发生特异结合的免疫蛋白。 13 抗体酶：是一种有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性，是抗体的高度选择性和酶的高度催化能力的巧妙结合物。 14 酶反应器：用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称其为酶反应器。

简答题 1 乳糖操纵子，色氨酸操纵子，葡萄糖效应 乳糖操纵子的实验现象： ①大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无lacz，lacy，laca三种酶。 ②大肠杆菌生长在唯一的碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶的合成，当换成葡萄糖是，三种酶消失。 实验结论：乳糖的存在可以诱导某些酶的合成。 乳糖操纵子的结构：大肠杆菌乳糖操纵子含lacz，lacy，laca三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶，透过酶，乙酰基转移酶，此外还有操纵子基因0，启动子p及基因I。 阻遏蛋白的负性调节： ①在没有乳糖时，乳糖操纵子处于阻遏状态，此时I基因产生的乳糖阻遏蛋白与操纵基因结合，由于空间的排挤作用，RNA聚合酶就无法结合到P序列的RNA聚合酶的结合位点，故阻断转录启动。 ②当乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导，其可以使阻遏蛋白构型发生变化，导致阻遏蛋白与操纵因子解离。使结构基因表达。 色氨酸操纵子： ⑴实验现象: ①大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合酶的存在。 ②在上述的培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶活性降低，直至消失。 ⑵实验结论： 色氨酸的存在阻止了色氨酸酶的合成，体现了菌体的经济原则，不生长就不合成。 ⑶色氨酸操纵子的结构： 由调节基因，启动子，操作基因和结构基因组成的。 ⑷在没有末端产物色氨酸的情况下，阻遏蛋白原处于无活状态，因此操纵基因的开关是打开的，这是结构基因的转录和翻译可以正常进行，参与色氨酸合成的酶大量合成；反之，当色氨酸存在时，阻遏蛋白原可以辅助遏物-色氨酸结合成一个有活性的完全阻遏蛋白，它与操纵因子相结合，使转录的开关关闭，从而无法进行结构基因的转录与翻译。

2酶生物合成的模式(合成的起点终点，mRNA的稳定性答题的要点) 通过分析比较酶的生产于细胞生长的时间关系，可以把酶生物合成方式分为四种类型：同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后和成型。 同步合成型：酶的生物合成与细胞的生长同步。当细胞进入对数生长期酶大量合成；细胞进入稳定期后，酶的生物合成随着停止。同步合成型也称为生长偶联型，属于这一类的酶其生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和合成反馈阻遏，而且当除去诱导物或细胞进入稳定期后，酶的生物合成就立即停止，表明这类酶对应的MRNA是极不稳定的。 延续合成型:酶的合成伴随着细胞的开始，但在细胞进入稳定期后，酶还可以延续合成较长一段时间。属于延续型的酶可受诱导，但不受分解代谢物阻遏和产物阻遏，而且该酶对应的MRNA相对稳定，可在生长稳定期相当长时间内继续用于酶合成。 中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入稳定期后，酶的合成也随之停止，该类酶的特点是，其合成受反馈阻遏，而且其对应的MRNA是不稳定的。 滞后合成型：只有细胞进入稳定期以后，酶才开始合成并大量积累，许多水解酶的生物合成属于这一类型，属于滞后合成型的酶在对数期不合成，可能受分解代谢阻遏作用的影响。当阻遏接触以后，酶才开始大量合成，加之其所对应的MRNA稳定性高，所以能在细胞停止生长以后，继续利用积累的MRNA进行翻译而合成酶。 3酶固定化的方法 吸附法：通过氢键、疏水作用、离子键等物理作用将酶固定于水不溶性载体表面的固定化方法。分为物理吸附法，离子交换吸附法。常用的有机载体：纤维素、淀粉、白蛋白;无机载体：硅藻土、皂土、硅胶。 结合法：是通过酶分子表面的功能基团与载体表面的功能基团发生化学反应实行的固定化方法。分为共价结合法（功能基团多是氨基、羧基及苯环）和离子键结合法（常用的载体DEAE-醋酸纤维、DEAE-葡聚糖凝胶）。共价结合需要先将载体活化其方法有：重氮法、叠氮法、烷基化法、硅烷化法、溴化氰。 包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中使酶固定化的方法。其包括网格型包埋（海藻酸钙包埋、琼脂凝胶、聚丙烯酰胺凝胶包埋）和微囊型包埋（界面沉淀、界面聚集、液体干燥法、脂质体包埋） 交联法：借助双功能试剂使酶分子直接发生交联作用制成网状结构的固定化酶的方法。常用的有：酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。常用的功能试剂是戊二醛。 固定化后酶性质的变化： 固定化对酶的活性的影响：酶活性下降，反应的速度下降。 固定化对酶稳定性的影响：操作稳定性提高；贮存稳定性比游离酶大多数提高；对稳定性大多升高，有些反而降低；对分解酶的稳定性提高；对变性剂的耐受力升高。 固定化酶的PH的变化：载体带负电荷，PH向碱性方向移动；载体带正电荷，PH向酸性方向移动。催化产物为酸性时，固定化酶的最适PH较游离酶的最适PH高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适PH较游离酶的最适PH低一些。 最适温度变化：酶的热稳定性提高，所以最适温度一般也随之提高。 固定化酶底物特异性的变化:作用于低分子底物的酶，固定化前后底物的特异性没有明显变化，而对那些既可以作用于大分子底物又可以作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。 固定化酶动力学参数的变化：当载体所带电荷与底物电荷相反时，固定化酶的表现Km值低于游离酶Km值；当载体所带的电荷与底物相同时，固化酶的表现Km大于游离酶的Km。 4 化学修饰的几种方法/修饰后酶的性质的改变 化学修饰的方法： 金属离子置换修：只适用于那些分子结构中本来含有金属离子的酶，用于金属离子置换修饰的金属离子一般都是二价金属，去除金属离子一般都用EDTA螯合剂。 大分子结合修饰：分为工价修饰和非共价修饰，常用的大分子修饰剂是水溶性大分子有：聚乙二醇，右旋糖苷，肝素，人的血清白蛋白。 侧链基因修饰：酶分子侧链常被修饰的功能基因主要有氨基，羧基，羟基，硫基，酚基。胍基等 肽链有限水解修饰：酶蛋白主链的修饰主要是靠酶切，酶原激活法。 氨基酸置换修饰：氨基酸和核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰，常用的发法是定点突变技术。 酶分子的物理修饰：常用特定的物理方法对酶分子进行修饰。 修饰后酶性质的变化： 1）修饰酶的稳定性得到提高：在空间上可固定的酶的构象使酶的热稳定性和耐蛋白酶水解稳定性提高。 2）修饰后抗原性得到降低：当酶被修饰后，酶分子表面上的许多抗原决定簇被修饰剂结合，使其被屏蔽降低了酶的抗原性。 3）修饰酶的半衰期得到延长：酶被修饰后由于增强了抗蛋白水解酶.抗抑制剂和抗失活因子能力，所以半衰期得到延长。 4）修饰酶的最适PH发生改变：最适PH 范围扩大了。 5）修饰酶的动力学性质：有些酶的Km值发生改变。 5酶分子定向进化的基本方法 定向进化：利用基因工程手段对酶的蛋白质分子进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。 易错PCR：在体外扩增基因时，使用适当的条件，使扩增的基因出现少量的碱基误配，引起突变。主要特点是能够控制它的突变频率，遗传变化只发生在单一分子的内部，属于无性进化。 过程：用DNA聚合酶链式反应（PCR）扩增的目的基因时，通过使用低保真度的TaqDNA聚合酶或改变PCR常规的反应条件，如调整反应体系中的4种DNTP的浓度，增加Mg2+浓度，添加Mn2+浓度等引起碱基以某一频率进行随机错配而引入多点突变，构建突变库，然后选择或筛选出所需的突变库。 DNA重组：又称有性PCR，它依赖PCR，是基因在分子水平进行有性重组，通过改变单个基因原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。 过程：从两种以上同源正突变基因出发，用酶切割成随机的片段，经过不加引物的多次PCR循环，是DNA的碱基序列重新排列而引起基因突变的技术过程。 此外还包括：外显子改组，随机引物体外重组，交错延伸。 6有机体系有什么优势 1） 有机介质的参与可以改变反应的平衡，是酶可以催化在水中不能进行的反应。 2） 能抑制依赖于水的某些不利反应和副产物。 3） 从有机溶剂中分离纯化产物比在水中容易，从低沸点的溶剂中可以更容易的分离纯化产物。 4） 酶在有机体系中的热稳定性和储存稳定性增加，而且可以有效减少反应过程中的微生物污染。 5） 可以控制底物的，区域选择性和立体选择性 6） 很多的情况下，可以实现游离酶的回收和再利用。 7） 有机溶剂的凝固一般低于水，使一些对温度敏感的酶可以在适宜的温度下进行催化反应。 7酶反应器的类型和特点 类型：按结构区分：搅拌罐式反应器，鼓泡式反应器，填床式反应式器，流化床式反应器，膜式反应器 操作方式：分批式反应，连续式反应，流加式分批反应 混合形式：连续搅拌罐反应器，分批搅拌罐反应器 反应器类型 适用的酶 特点