分子病理学技术新进展

分子病理学技术新进展•病理学的发展与使用的工具和方法的更新密切相关：解剖刀剪等—进行尸体检查—器官病理学显微镜—发明百年之后—细胞病理学电子显微镜—发展—超微病理学免疫组织化学—促进—免疫病理学分子生物学—带动—分子病理学计算机及网络—走进—信息病理学病理学技术就是如何应用新工具的方法和措施。

从发展过程看，在新工具面前必须首先解决使用的技术及其相应措施，才能在理论上有所发现。

所以，我们必须关注那些新工具、新方法，才能得以用于解决病理学中的问题。

病理学技术包括传统病理学技术和现代新技术•传统：Formalin固定，石蜡切片和HE染色及特殊染色技术—病理学的基本技术。

•新技术：免疫组化、原位杂交、原位PCR、凝胶电泳技术、核酸杂交技术（包括FISH、CGH）、PCR技术、基因重组技术、基因测序技术、细胞凋亡检测技术、细胞培养技术、流式细胞技术、激光共聚焦、显微切割技术、组织芯片技术、DNA芯片技术等等。

•根据科研和临床病理诊断的需要，不断建立和开展新技术，把传统技术和新技术相结合，不断提高病理学技术水平，逐步与国际水平接轨。

常规病理技术•近20余年来，常规病理技术也得到较大发展：➢微波方法缩短组织脱水、浸蜡时间；➢新的化学试剂取代传统的甲醛、二甲苯；➢逐步向自动化发展（全自动封闭式组织脱水机、全自动染色封片系统、全自动特殊染色机等）➢细胞病理学技术：传统的涂、刮片逐步向薄层液基细胞学发展TCT 液基细胞学检测新柏氏超薄细胞检测仪特殊染色技术•HE染色虽是一种快捷、经济、且易于掌握的方法，但它不能回答病因学、组织发生及发病机制等许多方面的问题。

为了显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等，需要分别选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色，固称特殊染色。

•在过去的20年里，由于免疫组织（或细胞）化学技术的迅速发展与广泛应用，特染的应用日趋减少，人们感到以组织化学为基础的特染方法似乎有些过时，但实际上它在诊断病理学及研究中仍然有着不可忽视的作用。

特殊染色的方法很多，常用的一些特殊染色的方法介绍如下：1、网织纤维染色（reticulin stains）显示网织纤维及基底膜物质。

传统的网织染色以银染为基础，有Gomori法,Wilder及Gordon 和Sweet法等，它们在肿瘤病理诊断中具有鉴别诊断作用：1）区别上皮与非上皮肿瘤；2）区别某些间叶组织肿瘤；3）区别原位癌与浸润癌。

2、PAS染色(periodic acid-schiff)可以显示糖原、中性粘液物质、基底膜、霉菌与寄生虫。

3、微生物特染最常用者是革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌染色法（B&B）、分枝杆菌染色、霉菌染色。

4、嗜银及亲银染色不需外加还原剂，在黑暗中即有还原银盐的能力，称为亲银性(argentaffin),代表方法Fontana-Masson法。

而需外加还原剂或在光线存在时才有还原能力，称为嗜银性（argyrophilic）, 代表方法是非改良的Grimelius法。

5、淀粉样染色刚果红（congo red）是最可靠且实用的检测淀粉样物质的方法。

6、三色染色（trichrome stains）可分别显示细胞核、细胞浆及细胞外胶原。

7、磷钨酸苏木素染色（PTAH染色）一种三色染色的特殊类型，用于显示肌组织及胶质细胞胞浆内的微丝。

8、含铁血黄素、黑色素及钙染色显示含铁血黄素首选Perls普鲁士兰反应(Prussian blue)。

Fontana-Masson 法是用含氨盐溶液显示黑色素的方法。

在显示钙的染色中，von Kossa 法常用。

9、中性脂质染色油红（Oil red）是最常用的染色方法，但不能用于石蜡包埋的组织。

中性脂质（lipids）最常用于肿瘤的诊断与鉴别，可区别卵巢纤维瘤及泡膜细胞瘤、皮脂腺癌与鳞状细胞癌等。

10、粘液染色（mucin stains）粘液染色法中，阿尔辛蓝(Alcian blue)和PAS联合可显示中性、轻度酸性及高度酸性粘液物质，故是最好的全粘液(pan- mucin)染色法。

11、Giemsa染色常用于涂片及切片染色。

可清楚的显示并区分不同分化阶段的淋巴造血细胞，并可将肥大细胞浆染成紫红色颗粒，故在上述瘤性及反应性增生的诊断中有重要作用。

12、髓鞘（myelin）染色分正常髓鞘染色和变性损伤髓鞘染色。

最常用的方法为Luxol坚固蓝(Luxol fast blue)法。

13、弹性纤维（elastic fibers）染色最常用Weigert法及Verhoeff van Gieson (VVG) 法，一般认为前者特异，后者快速且清楚。

实践篇准备阶段•（一）抗体购买试剂公司的选择•北京中杉、福州迈新•Leica、BioGenex(北京英硕力代理)、Santa Cruz （北京中杉代理）•上海太阳、上海长岛•武汉博士德、北京博奥生•（二）组织处理1、组织要新鲜冰冻切片离体后尽快冻存石蜡切片要尽快固定2、主要病灶区取材3、组织块V：1×1×0.2cm•（三）标本固定1、10％的中性福尔马林为常用的固定剂，对蛋白损伤少，能保存大部分组织结构。

2、固定时间6－12小时，以不超过48小时为宜。

3、固定液的量一般应为组织块总体积的4~5倍,也可达15~20倍。

（四）脱水、透明、包埋1、脱水透明室温条件即可。

2、浸蜡包埋温度根据蜡的熔点确定（60－70度）。

（五）载玻片处理与切片制作1、新载玻片硫酸浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水洗涤，置37℃温箱内烘干。

2、将载玻片浸入现配的1：50APES丙酮液1分钟，入纯丙酮溶液洗除未结合的APES，自然晾干。

3、切片厚度3－5μm，65℃温箱烤片2－4小时。

操作阶段•热修复：高压、微波等•双暴露：酶+热修复抗体浓度常用0.01mol/L pH7.4 的PBS 或TBS 缓冲液作抗体稀释液。

选择最佳一抗、二抗稀释浓度。

对照选择•用PBS液代替一抗做阴性对照；•用已知阳性的组织切片做阳性对照。

证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。

结果判断特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布在细胞核和细胞表面的，即具有结构性。

特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。

非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色。

常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。

免疫组化结果的判断原则：•1、必须设对照•2、抗原表达必须在特定部位•3、阴性结果不能视为抗原不表达•4、免疫组化与HE切片诊断应以HE切片诊断为准细胞浆阳性表达膜阳性表达细胞核阳性表达提高IHC方法敏感性的辅助手段免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策•无色片（即无阳性信号）•“杂音”染色片（有阳性信号）1、全片着色2、切片边缘着色3、“阴阳脸”着色4、灶片状着色5、间质着色6、细胞浆着色7、细胞核着色免疫组化染色影响因素•影响免疫组化染色质量的因素有很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段，严格的技术操作和对照等。

•注意组织的取材和固定•假阴性问题•假阳性问题免疫组化自动染色仪分子病理学相关技术•原位杂交•荧光原位杂交(FISH)•多聚酶链式反应技术（PCR）•原位PCR•显微切割技术（micro-dissection）•基因测序技术•生物芯片技术Southern印迹杂交法•1975年首先由苏格兰爱丁堡大学Southern报告•1981年Korsmeyer等首先将其应用于基因重排•其原理是：两条单链DNA碱基可与人工合成的互补单链DNA探针相结合（一般用同位素标记）。

原位杂交•原位杂交(in situ hybridization，ISH)是核酸分子杂交的一部分，是将组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。

根据所选用的探针和待检靶序列的不同，有DNA-DNA 杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。

原位杂交技术的应用•①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；•②感染组织中病毒DNA／RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人乳头状瘤病毒（HPV）、乙型肝炎病毒(HBV)和巨细胞病毒DNA的检测；•③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；•④基因在染色体上的定位；•⑤检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等；•⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。

HPV原位杂交结果HPV原位杂交结果HPV原位杂交结果原位杂交和免疫组化染色技术比较•IHC使用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原—抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；•ISH使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待检靶序列结合，是DNA或mRNA水平的检测。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

FISH技术的特点FISH探针的种类FISH技术在临床中的应用•血液病检测•产前诊断•实体瘤检测多聚酶链反应扩增(PCR)•1985年首先由美国Mullis 等设计成功•目前临床开展的PCR检测项目主要应用于遗传病的产前诊断、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA指纹、亲子关系鉴别及法医物证等方面。

•随着PCR技术的不断发展，针对各种需要，衍生出许多类型的PCR方法，包括巢式PCR 、复合PCR 、反向PCR 以及实时定量PCR 等，尤其是实时定量PCR，通过监测PCR反应过程中荧光信号描绘扩增曲线，对起始模板进行定量，现在也已经广泛地应用于临床，如病毒的拷贝数等。

原位多聚酶链式反应技术(PCR in situ)•原位PCR技术是多聚酶链式反应技术的一个类型，是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合，在冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上来检测和定位核酸。

其敏感性比原位杂交高出2个数量级，是形态学和分子生物学前沿交叉的产物。

原位PCR技术的应用•原位PCR技术能用于低拷贝的内源性基因的检测和定位，在完整的细胞样本上能检测出单一拷贝的DNA序列，可用于基因突变、基因重排和染色体易位等的研究和观察；•外源性基因的检测和定位，如对各种感染性疾病病原的基因检测，如EB病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒基因组及结核、麻风杆菌基因的检测等•临床上还可用于对接受了基因治疗患者体内导入基因的检测等。