单克隆抗体制备技术研究进展_朱学泰

单克隆抗体制备技术研究进展朱学泰1;谢　溱2;马瑞君1(1.西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州　730070;2.兰州生物制品研究所,甘肃兰州　730046)

摘　要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。本文主要对以上几种制备单抗的新技术作一综述。关键词:单克隆抗体;人源抗体;转基因小鼠;展示技术中图分类号:R181.36

1975年,Kohler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体,此后单克隆抗体迅速广泛地应用于生物学和医学的各个领域。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系;生产出针对复杂生物混合物中的特定分子的抗体,可用于分离、分析及纯化该特定分子抗原;其试剂可用于临床诊断和治疗,或用于以单抗为弹头的“生物导弹”药物等。但单克隆抗体技术自问世以来,在临床治疗方面进展缓慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的,而鼠源单抗应用于人体治疗时存在诸多问题:鼠源单抗在人体中常不能有效激活补体和Fc受体相关的效应系统;被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体(HAMA)反应;且在人体循环系统中很快被清除。因此,在保持对特异抗原表位的高亲和力的基础上人源化和全人化的改造,减少异源抗体的免疫原性成为单抗研究的重点。此外,传统杂交瘤技术还存在制备周期较长,成本较高,杂交瘤细胞不稳定抗性会丢失等缺陷。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所制备的单克隆抗体。这些技术可有效解决传统杂交瘤技术所存在的问题,为单克隆抗体的应用提供更广阔的空间。1　嵌合单克隆抗体嵌合单克隆抗体产生于1980年代中期,是应用DNA重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组,再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物,选用适当的抗生素或试剂进行筛选,再用与传统杂交瘤技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。1980年代中后期,科学家对嵌合抗体进一步改进后,抗体基因只有互补性决定区(CDR)是鼠源成分,其余均为人基因序列,这实现了抗体的高度人源化。嵌合抗体不但具有与鼠源单抗相同的特异性、亲和力和产量,而且可根据不同的需要接上不同亚类的人恒定区基因来改变抗体的功能,使用更加灵活。第一个人源化单抗rituxan是一个抗CD20的人鼠嵌合型单抗,在非何杰氏恶性淋巴瘤患者的治疗中取得了良好的疗效。目前,嵌合单克隆抗体基本主宰着治疗性单抗的商品市场,截止到2003年初,共有9个单克隆抗体被美国FDA授予生物药许可证,都是人鼠嵌合抗体或人源化的抗体类型。虽然CDR仅占整个嵌合抗体分子的5%以下,但仍有鼠源成分的存在,并未完全解决鼠抗体的免疫原性问题,而且人源化过程繁复且费用昂贵,大量的反复试验不可避免。因此又发展出了产生全人单克隆抗体的技术。

2　转基因小鼠1994年,美国CellGenesys公司和Genpharm公司宣布转基因小鼠作为生产全人抗体的载体问世。这项技术是将人抗体基因微位点转入小鼠体内,产生能分泌人抗体的转基因小鼠。其前提是人的抗体基因片段在小鼠体内进行重排并表达,并且这些片段能与小鼠细胞的信号机制相互作用,即在抗原刺激后,这些片段可被选择、表达并活化B细

第21卷　第3期2005年3月 甘肃科技GansuScienceandTechnology Vol.21　No.3March.　2005胞分泌人抗体。这些转基因小鼠的不足之处在于转移基因片段较小,仅30kb左右,因此这种抗体库在面对抗原多样性时,其抗体应答显得单薄而不足。此后,Green等人利用基因打靶技术将编码人抗体轻重链的基因片段大约18Mb的DNA全部转到自身抗体基因位点已被灭活的小鼠基因组中,再经过繁育筛选,建立了稳定的转基因小鼠品系。这样得到的转基因小鼠对特异的抗原能产生高亲和力的人抗体。用传统的杂交瘤技术,将表达特异抗体的转基因小鼠B细胞和骨髓瘤细胞融合,获得杂交瘤细胞系,产生人源抗体。利用转基因小鼠技术已获得了一系列抗IL8、TNFα以及EGFR的人单克隆抗体,这些细胞因子在肿瘤或其他疾病中起着重要的作用,因此其单克隆抗体作为导向剂具有重要的临床治疗意义。3　噬菌体展示技术噬菌体展示技术建立在噬菌体外壳具有表达抗体蛋白片段能力的基础上。这项技术的基本原理是:用基因工程技术克隆人抗体可变区的全套基因,然后将克隆的基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中,建立噬菌体抗体文库。这样在噬菌体表面表达特定抗体片段,而在噬菌体核心DNA中则含有该抗体片段的基因。噬菌体库包括多种抗体可变区的基因序列,一些噬菌体抗体文库已经含有达到1011种不同的噬菌体抗体。抗体的具体制备方法是将抗原包被在固项介质上,加入待筛选的噬菌体颗粒与固定的抗原结合,获取结合的抗体,将未结合的抗体洗脱,从噬菌体库中筛选出针对特定抗原的特异性抗体的可变区。用表达有相应抗体分子的噬菌体颗粒去感染宿主菌,使该噬菌体颗粒得到扩增。将抗体可变区与恒定区组合得到具有完整功能的全人单克隆抗体。噬菌体展示技术的最大优点是一旦噬菌体库建立后,就可以根据需要直接从文库中筛选得到针对目标抗原的特异性抗体,通常只需要23周的时间,大大缩短了单克隆抗体的制备周期。当抗体分离出来时,噬菌体系统同时也提供了设计抗体亲和性及其应用的模式。但是该技术也存在一定的缺陷,由于受表达系统的限制,抗体库的库容不足以支持获得稀有的抗体,而且对噬菌体或表达宿主的生长或功能产生抑制作用的抗体也难以获得。4　核糖体展示技术转基因小鼠和噬菌体展示技术均依赖于细胞技术和体内基因的表达,所建库的容量和分子多样性最终要受到转化效率、胞内环境等诸多因素的限制。因此,建立不受细胞转染和表达等因素影响的完全体外展示系统成为必然。新发展的核糖体展示和共价展示技术就属于无细胞转化技术,成功地解决了这些问题。要建立体外蛋白质分子筛选系统,遗传分子必须附着在蛋白质分子上,并在蛋白质合成过程结束时形成一种稳定的遗传分子-蛋白质复合体,才能保证筛选后的复制与扩增。利用蛋白质生物合成的主要场所核糖体作为基因型和表型相偶联的纽带,形成抗体-核糖体-mRNA复合物是核糖体展示技术的基本原理。先扩增目的抗体基因DNA文库,同时加入启动子、核糖体结合位点,转录形成mRNA。在核糖体展示系统中,mRNA的终止密码子被除去,以防止新转录的抗体蛋白被释放,使抗体始终与对应的mRNA联系在一起。在无细胞翻译系统(如E.coli裂解液和麦胚提取物)中孵育,核糖体与mRNA结合,并在mRNA分子上移动组装肽链。在此过程中可以通过调节无细胞翻译系统的环境以确保抗体分子的正确折叠。核糖体展示系统的抗体筛选过程与噬菌体展示系统的过程相类似。核糖体展示技术的主要优点是一方面能产生更大的抗体库,库容可达到1015,另一方面可以方便地与一些特殊的PCR技术,如性别PCR、错配PCR等结合,获得更多的抗体遗传多样性,而且所表达的抗体具有正确的空间折叠构象。核糖体展示技术已经成功地用于生产抗黄体酮的抗体片段。

5　RNA-多肽融合技术利用核糖体展示技术在筛选过程中,由于核糖体是相对分子量为2000000的大分子,而一个典型的肽库或抗体库中可供选择的分子大小一般都小于100000。这样在核糖体大分子和被展示的小分子之间由于空间位阻可能会产生一些不可预知的变化,导致目标分子的丢失。由Phylos公司开发的RNA-多肽融合技术基本克服了这一缺点。RNA-多肽融合技术是将mRNA的3′末端和抗体蛋白质的羧基端借助嘌呤霉素分子共价连接在一起。具体方法是抗体库中的DNA转录出RNA后,在mRNA的3′端共价连接一个嘌呤霉素标记的DNA片段,作为合成的衔接物。在体外无细胞翻译系统中转录时,核糖体在mRNA分子上移动合成多肽。当到达mRNA分子末端时,(下转第98页)

109第3期 朱学泰等:单克隆抗体制备技术研究进展3　控制算法根据液压系统的特点,本系统,在正常情况下,用普通的PID计算,当系统达不到控制要求,采用采用修正的PID控制方法。正常的离散的PID算式为:

Ui=l[ei+T/T∑ij=0ej+Td/T(ei-ei-1-1)]+U0ei:偏差U0:偏差为零时的控制作用k:比例系数T:积分系数T:微分系数以上为位置式算法,U和一般的PID控制不一样,在偏差为零时,必须输出U。■Ui=k[ei-ei-1+T/Tiej+Td/T(ei-2ei-1+

ei-2)在实际应用中,采用增量式PID算法,这是由于增量式算法只需保持先时以前3个时刻的偏差即可,误差不会积累,最后输出可用下式计算:Ui=Ui-1+■Ui

当反馈未到达控制要求,但按正常情况下控制

几个周期反馈不改变时,此改变控制参数改变加大控制输出,直到系统输出达到要求。这相当于当正常PID控制达不到控制要求时,改进算法使其达到控制效果。4　控制系统异常处理当系统响应进入加载实验时可以设置最大控制量,当超过最大控制量时,按系统设定的卸载规则进行控制卸载,如可按指定比例卸载,紧急卸载等。这样可以保护被测物体不被损坏,当超过被测物体规定的最大量值时,系统自动保护。5　控制效果,运行曲线见图1,控制效果理想。

图16　控制系统性能指标＊系统可实现疲劳、静力、拟动力和随机波等多种实验。可以满足结构试验的各种不同要求。＊控制命令可以是载荷,也可以是位移。＊可手动控制,也可自动控制,并实现两种控制平滑切换。＊用户方便的设置试验谱,可产生正弦波、三角波、方波,水平线和梯形波等。＊提供实验时在线控制曲线显示,曲线可任意放大或缩小。＊为用户保存数据提供了灵活手段,用户可设置保存时间间隔,选择哪个通道数据需要保存。

7　结束语本系统采用多种控制策略,在实际运行中取得了良好的效果,动态响应和静态响应达到了预期要求。参考文献:[1]　李运华,史维祥等.近代液压伺服系统控制策略的现状与发展.液压与气动,1995(1):3～6[2]　王瑶,液压传动与控制教程.天津大学出版社

(上接第109页)核糖体停止在mRNA与DNA片段的连接处,嘌呤霉素就会进入核糖体的酰氨化位点,并在肽酰转移酶的作用下与多肽之间形成稳定的酰胺键。所得到的多肽-嘌呤霉素-mRNA复合物与核糖体分离后可直接进行筛选。多肽-嘌呤霉素-mRNA复合物较mRNA-核糖体-蛋白复合物更为稳定,实验证明mRNA-核糖体-蛋白复合物可以在4℃条件下完整保存10天左右,并允许剧烈的亲和筛选,足以筛选到高亲和性的抗体。由于该技术采用共价偶联的方法,因此也被称为共价展示技术。6　结语随着人类基因组计划的顺利进行,单克隆抗体因其高度的特异性,必将会在对蛋白质的细微结构进行深入研究中起更加重要的作用。由于噬菌体展示技术、核糖体展示技术及RNA-多肽融合技术的兴起,使得单克隆抗体制备周期缩短、成本大大降低,更有利于用做诊断、提纯和研究用的试剂。全人单克隆试剂用于临床治疗感染性疾病、肿瘤、器官移植、血液性疾病、中毒性疾病、变态反应性疾病、自身免疫性疾病等,具有更高的安全性。