螺旋藻色素蛋白复合物的分离工艺

食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2012年 第37卷 第5期提取物与应用

· 236 ·螺旋藻(Spirulina)是一种丝状多细胞螺旋形藻类生物，也是一种优良的纯天然食品[1]。由于其含有极丰富均衡的营养成分和多种生物活性物质，被联合国粮农组织推荐为“全球人类最理想的食品”。螺旋藻中的捕光色素蛋白复合物(Light-harvesting Complex，LHC)是一类捕获光能，并将其迅速传至光合反应中心引起光化学反应的色素蛋白系统[2]。其中LHC-2占有类囊体膜中近50%的色素和约1/3的蛋白质，生理功能复杂且易被大量分离和纯化而备受关注。螺旋藻中的重要捕光蛋白是藻胆蛋白(Phycobiliproteins)，它是一种存在于蓝藻细菌、真核红藻和隐藻内的色素结合蛋白，在生物体内捕获光线并且引导能量向光合系统2反闫 岩1，傅 红1*，杨 琳2，张新明1(1.福州大学生物科学与工程学院，福州 350108；2.厦门市海洋职业技术学院，厦门 361100)摘要：对螺旋藻色素蛋白的分离工艺进行了研究。使用超声波破碎螺旋藻获得螺旋藻色素蛋白复合物粗提液。以可溶性蛋白和藻蓝蛋白浓度为指标，研究硫酸铵沉降和等点点沉降2种分离方法对蛋白分离的影响。通过光谱扫描和SDS-PAGE比较，使用调节pH沉淀杂蛋白分离方法，能得到藻蓝蛋白纯度达到0.89的食品级色素蛋白复合物。结果表明，此方法适合规模化分离螺旋藻中的藻蓝蛋白，在食品工业中有一定的应用前景。关键词：螺旋藻；色素蛋白复合物；蛋白分离；等电点沉降；SDS-PAGE中图分类号： TS 201.2+1 文献标志码： A 文章编号：1005-9989(2012)05-0236-04Separation process of Spirulina pigment-protein complexYAN Yan1, FU Hong1*, YANG Lin2, ZHANG Xin-ming1(1.College of Biological Science and Technology, Fuzhou University, Fuzhou 350108; 2.Xiamen Ocean Vocational College, Xiamen 361100)Abstract: The separation process of spirulina pigment-protein complex was studied. Through ultrasonic fragmentation, the crude spirulina pigment-protein complex (SPP) was extracted. The experiment compared the effect of ammonium sulfate precipitation and isoelectric point precipitation by measuring the concentration of soluble protein and phycocyanin. Different processes were compared by UV-vis spectrum scan and SDS-PAGE, and phycocyanin with a purity of 0.89 considering as a food grade was obtained by adjusting pH value for impurities precipitation. The result showed that the method had high application value to be commercial process in food industry to obtain phycocyanin from spirulina. Key words: Spirulina; pigment-protein complex; protein separation; pI precipitation; SDS-PAGE收稿日期：2011-09-13 *通讯作者基金项目：福建省科技厅重点项目(2010N01010312)；福州大学科技发展基金项目(2009-XQ-21)。作者简介：闫岩(1987—)，男，硕士研究生，研究方向为食品安全与检测。螺旋藻色素蛋白复合物的分离工艺食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2012年 第37卷 第5期提取物与应用

· 237 ·应中心迁移[3]。研究表明藻蓝蛋白具有显著的抗氧化和抗炎能力[4]。目前色素蛋白复合物的研究集中在生化分离方向[5-6]，其工业化分离研究和在食品中的功能性研究较少。本文通过比较两种螺旋藻色素蛋白复合物分离方法，寻找规模化生产的理论依据，为螺旋藻的高值化利用提供基础数据。1 材料与方法1.1 材料螺旋藻：福建神六保健食品有限公司，新鲜螺旋藻于-20 ℃条件下冷藏；蛋白质Marker：厦门鹭隆；其他试剂均为市售分析纯。1.2 仪器与设备JY-92型超声细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；BS-210S型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；3K-15型离心机：美国Sigma公司；B-290型喷雾干燥机：美国B-CHI公司；XW-80A型漩涡混合器：上海精科实业有限公司；Lambda35型紫外-可见分光光度计：美国Perkin Elmer公司；PHSJ-3F型实验室pH计：上海雷磁仪器厂；KJELTEC2300全自动定氮仪：丹麦FOSS公司；DYY-6C型双稳定时电泳仪、DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳槽：北京市六一仪器厂。1.3 实验方法1.3.1 螺旋藻色素蛋白复合物的提取方法 使用超声波破碎法提取螺旋藻色素蛋白复合物[7]。将冷冻螺旋藻置于室温下解冻，称取10.0 g螺旋藻于烧杯中，加入pH7.0，0.1 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(料液比1:3，w/v)，随后进行超声波破碎，破碎条件为：超声作用时间4 s，间歇时间8 s，超声功率500 W，工作次数100次。静置1 h后，于20 ℃下10000×g离心10 min，收集上清液。1.3.2 螺旋藻可溶性蛋白浓度的测定 使用Bradford法[8]测定螺旋藻中的可溶性蛋白。1.3.3 螺旋藻色素蛋白复合物含量的测定 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其鉴定的标准，本实验以藻蓝蛋白为指标测定螺旋藻色素蛋白复合物。使用可见光分光光度计测定，并按照下式进行计算[9-10]：[PC]=0.187A620-0.089A652…………………………(1)[APC]=0.196A652-0.041A620 ………………………(2)[PE]=0.104A562-0.251[PC]－0.088[APC] …………(3)式中：[PC]为测试液中藻蓝素浓度，mg/mL； [APC]为别藻蓝素的浓度，mg/mL； [PE]为藻红素的浓度，mg/mL； A为相应波长处(562 nm，620 nm，652 nm)测得吸光值。1.3.4 螺旋藻色素蛋白复合物的分离方法1.3.4.1 硫酸铵沉降法 在室温下，准确称取一定量的固体硫酸铵，将硫酸铵缓慢加入到提取液中，磁力搅拌器同时进行缓慢搅拌，使硫酸铵溶解充分并防止局部浓度过高，静置1 h后，在20 ℃下10000×g离心10 min，吸取并稀释上清液，测定其可溶性蛋白和螺旋藻色素蛋白复合物浓度。1.3.4.2 等电点沉降法 根据文献[11]报道，藻蓝蛋白根据螺旋藻种类有所差异其等电点在4.3~5.0之间。使用0.1 mol/L HCl溶液调节提取液pH值，静置1 h后在4 ℃下10000×g离心10 min，吸取并稀释上清液，测定其可溶性蛋白和螺旋藻色素蛋白复合物浓度。沉淀加入1/4上清液体积的pH7.0 PBS中充分溶解，4 ℃下10000×g离心10 min，吸取并稀释上清液，测定其可溶性蛋白和螺旋藻色素蛋白复合物浓度。1.3.5 藻蓝蛋白回收率、纯度和分离因数 计算藻蓝蛋白回收率(R)、纯度(P)和分离因数(β)等分离指标如下所示[12]：………………………(4)………………………………(5)……………(6)式中：R为回收率，%； Vt，Vo为蛋白溶液的最终体积和起始体 积，mL； P为藻蓝蛋白纯度； A为相应波长处(280 nm，620 nm)测得 吸光度； Β为藻蓝蛋白分离因数； 下标o和t分别代表分离前和分离后的蛋 白溶液。1.3.6 螺旋藻色素蛋白复合物的电泳检测 SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行[1]，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%。采用恒压电泳，电压200 V。用0.1%考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察结果。2 结果与讨论2.1 考马斯亮蓝溶液标准曲线的绘制3󰀉󰀆󰀊󰀞 1󰀉󰀆󰀊󰀞"620/A280¤󰀉󰀆󰀊󰀞󰀉1$󰀊Uf7U󰀉1$󰀊Pf7Pf󰀒󰀑󰀑󰀉1$󰀊U󰀐󰀉1$󰀊P󰀉"1$󰀊U󰀐󰀉"1$󰀊P󰀌󰀉1&󰀊U󰀐󰀉1&󰀊P食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2012年 第37卷 第5期提取物与应用

· 238 ·将实验中得到的吸光度与对应浓度进行一次线性回归计算，在蛋白质浓度在0~0.1 mg/mL范围内得到回归方程y=4.5879x+0.0253，回归率R2=0.9928，说明线性关系良好，可以用于检测可溶性蛋白的浓度。2.2 硫酸铵分离螺旋藻色素蛋白复合物条件的确定硫酸铵沉降是常用的蛋白质盐析方法，能够起到浓缩及初步分离纯化蛋白质的作用。不同硫酸铵饱和度对螺旋藻粗提液中蛋白的作用如图1所示。间，别藻蓝蛋白等电点也在这一范围内[7]。选择合适的pH值就可以将目标蛋白和杂蛋白进行有效地分离。不同pH值对螺旋藻粗提液中蛋白的作用如表1所示。通过表1可知，利用等电点沉降法在沉淀中提取螺旋藻色素蛋白复合物的效果不理想，纯度最高为0.58，分离因数为2.42，这与刘杨[12]等人的结论基本一致。从沉淀复溶的数据中可以发现，pH值在4.0~4.2之间藻蓝蛋白纯度较高，由此推测藻蓝蛋白等电点在4.0~4.2之间，而其他藻蛋白等电点远离这个pH值区间，使得藻蓝蛋白在总蛋白的比重上升，纯度升高。通过调节pH值沉淀杂蛋白制备螺旋藻色素蛋白复合物，在pH4.6时，上清液纯度达到0.89(食品级)[11]，分离因数也高于刘杨[12]等人所报道，此时pH值不在藻蓝蛋白等电点处，大部分藻蓝蛋白溶解于上清液中。藻蓝蛋白纯度在pH4.6时达到最高，同时沉淀中藻蓝蛋白纯度仅为0.34，可以推断杂质蛋白的等电点在pH4.6附近，此时大部分杂蛋白形成沉淀，从而达到分离目的。实验确定螺旋藻色素蛋白复合物的等电点沉降提取条件：将粗提液pH调至4.6，静置1 h后10000×g下离心10 min，取上清液调节pH至中性后喷雾干燥待用。2.4 不同方法提取螺旋藻色素蛋白复合物的比较通过硫酸铵分级分离法和等电点沉降法分别得到2种螺旋藻色素蛋白复合物干燥粉末，其性质见表2。表2 螺旋藻色素蛋白复合物干粉的性质名称粗蛋白含量/%总蛋白回收率/%PR/%βSPPc43.08±0.121000.381000.50SPP142.94±0.0876.35±0.120.4572.391.16SPP246.85±0.1732.76±0.230.8947.661.67 注：SPPc为螺旋藻色素蛋白复合物粗提液；SPP1为硫酸铵沉降制备得到的螺旋藻色素蛋白复合物；SPP2为调节pH沉淀杂蛋白制备得到的螺旋藻色素蛋白复合物。硫酸铵沉降是实验室制备蛋白的常用方法。通过比较，硫酸铵沉降制备得到的螺旋藻色素蛋白复合物SPP1的总蛋白回收率较高，但是其藻蓝蛋白纯度较低；而调节pH沉淀杂蛋白制备得到的螺旋藻色素蛋白复合物SPP2的藻蓝蛋白纯度较高，回收率、纯度和分离因数均高于参考文献[12]所报道，在纯度和分离效果上也优于SPP1，说明此方法对蛋白质分离的选择性强，这为后续的纯化工作带来了便利。藻蓝蛋白在620 nm处具有特征吸收峰。通过图1 硫酸铵饱和度对蛋白溶解性的影响󰀁󰀑󰀏󰀑󰀑󰀏󰀖󰀒󰀏󰀑󰀒󰀏󰀖󰀓󰀏󰀑󰀓󰀏󰀖󰀔󰀏󰀑󰀑󰀒󰀑󰀓󰀑󰀔󰀑󰀕󰀑󰀖󰀑󰀗󰀑󰀘󰀑󰀙󰀑⶗䚤䨡亝󰦸󱏒󰀐󰀆㬧㨉㯷⮩㏛󱏒󰀐󰀉NH󰀐N-󰀊󰀁󰀑󰀏󰀑󰀓󰀏󰀖󰀖󰀏󰀑󰀘󰀏󰀖󰀒󰀑󰀏󰀑󰀒󰀓󰀏󰀖󰀒󰀖󰀏󰀑󰤛⏢󱕓㯷⮩≿󱏒󰀐󰀉NH󰀐N-󰀊㬧㨉㯷⮩󰤛⏢󱕓㯷⮩由图1可知，上清液可溶性蛋白浓度和藻蓝蛋白浓度在硫酸铵浓度达到20%前无明显下降，在饱和度达到20%～50%时，蛋白随着饱和度增加而大量析出，在50%时绝大部分蛋白已析出。通过实验确定螺旋藻中色素蛋白复合物使用硫酸铵沉降的分离条件为：在粗提液中加入20%饱和度的硫酸铵，沉降离心后取上清液并将硫酸铵饱和度调高至50%，10000×g离心10 min后将沉淀复溶，使用磷酸盐缓冲液透析后喷雾干燥待用。2.3 等电点沉降分离螺旋藻色素蛋白复合物条件的确定表1 pH值对螺旋藻色素蛋白复合物分离的影响pHR/%Pβ上清液4.0 20.89 0.51 3.92 4.2 37.43 0.67 4.34 4.4 36.58 0.86 2.41 4.6 47.66 0.89 1.67 4.8 50.81 0.75 1.04 5.0 75.54 0.31 0.59 沉淀复溶4.0 56.27 0.58 2.42 4.2 45.61 0.55 1.64 4.4 56.93 0.21 0.74 4.6 46.33 0.34 0.50 4.8 44.31 0.28 0.47 5.0 22.53 0.23 0.26 根据品种不同，藻蓝蛋白等电点在4.0~5.3之