环境工程微生物学实验指导

1 实验一 光学显微镜的操作及细菌、放线菌和

蓝细菌个体形态的观察

Ⅰ、显微镜的使用

一、实验原理

微生物学研究用的显微镜通常有低倍物镜(16mm，10)高倍物镜(4mm，40-45)和油镜(1.8mm，95-100)三种。油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。

使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n＝1.52，与玻璃基本相同。当光线通过载玻片后， 可直接通过香柏油进入物镜

而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了(图Ⅰ-1)。

利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值口径。因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：

2sinnAN

式中 数值孔径AN

介质折射率n

最大入射角，即镜口角

数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。

AN2能辨别两点间最小距离

式中 =光波波长

由上述可知若n值和α角越大则N·A越大或光波波长越短，则显微镜的分辨力越大(图Ⅰ-2)。

一些物质的折射率： 2 水 1.33 玻璃 1.52 空气 1.0 香柏油 1.515。

二、实验器材

1、 仪器 显微镜；

2、 材料 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)标本片，香柏油，二甲苯，擦镜纸。

三、操作步骤

1、取镜 显微镜是光学精密仪器，使用时应特别小心。从镜箱中取出时，一手握镜臂，一手托镜座，放在实验台上。在使用时要特别小心。使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否完全合用，镜身有无尘土，镜头是否清洁。做好必要的清洁和调整工作。显微镜构造见图Ⅰ-3

2、调节光源

1) 将低倍物镜旋到镜筒下方，旋转粗调螺旋，使镜头和载物台距离约为0.5厘米左右。

2) 上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。

图Ⅰ-3 光学显微镜的构造

1. 物镜转换器 2. 接物镜 3.游标卡尺 4.载物台 5.聚光器 6. 彩虹光阑 7.光源

8. 镜座 9. 电源开关 10. 光源滑动变阻器 11. 粗调螺旋 12. 微调螺旋

13. 镜臂14.镜筒 15.目镜 16.标本移动螺旋

3) 左眼看目镜调节反光镜镜面角度(在天然的光线下观察，一般用平面反光镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜)。开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的照明为止。

一般染色标本油镜检查对，光度宜强，可将光圈开大，聚光器上升到最高，反光镜调至最强；未染色标本，在低倍镜或高倍镜观察时，应适当地缩小光圈，下降聚光器，调节反光镜，使光度减弱，否则光线过强不易观察。

3、低倍镜观察 低倍物镜(8或10)视野面广，焦点深度较深，为易于发现目标确定检查位置，故应先用低倍镜观察为宜。操作步骤：

1) 先将标本玻片置于载物台上(注意标本朝上)，并将标本部位处于物镜的正下方、转动粗调螺旋，上升载物台使物镜至距标本约0.5厘米处。

2) 左眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节螺旋使载物台缓慢上升，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物象，及时确定需进一步观察的部位。

3) 移动推动器。将所要观察的部位置于视野中心，准备换高倍镜观察。 3 4、高倍镜观察 将高倍物镜(40)转至镜筒下方(在转换物镜时，要从侧面注视。以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞)，调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。

5、油镜观察

1) 用粗调螺旋提起镜筒，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方向慢慢转动粗调螺旋，上升载物台，并及时从侧面注视使油浸物镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止(注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头)。

2) 左眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下降载物台(注意：此时只准下降载物台，不能向上调动)，当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。

3) 如果向上转动粗调螺旋已使镜头离开油滴又尚未发现标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。

4) 观察完毕，下降载物台，取下标本片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。

5) 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。

四、注意事项

1、显微镜镜头的保护和保养

2、使用显微镜时应据不同的物镜而调节光线

Ⅱ、细菌、放线菌和蓝细菌

个体形态的观察

一、仪器和材料

1、 显微镜、擦镜纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯。

2、 示范片：大肠杆菌（杆状）、小球菌（球状）、硫酸盐还原菌（弧形）、枯草芽孢杆菌、放线菌、颤藻、鱼腥藻或念珠藻等。

二、试验内容和操作方法

1、严格按照光学显微镜操作方法，依低倍、高倍和油镜的次序观察杆状、球状、弧状和丝状的细菌示范片，用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。

2、同法逐个观察放线菌的示范片，分别绘出其形态图。 4 3、同法逐个观察颤藻、鱼腥藻或念珠藻的示范片，分别绘出其形态图。

实验二 酵母菌、霉菌、藻类、原生动物及微型后生

动物个体形态的观察

一、实验目的

1、进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法。

2、观察几种真核微生物的个体形态，掌握生物图的绘制方法。

3、学习压片滴法制作标本片。

二、仪器和材料

1、显微镜、擦镜纸、吸水纸。

2、酵母菌、霉菌示范片，藻类培养液及生活污泥混合液。

三、试验内容和操作方法

1、严格按照光学显微镜操作方法，依低倍、高倍和油镜的次序观察酵母菌和霉菌示范片，用铅笔分别绘出其形态图。

2、用压滴法制作藻类、原生动物和微型后生动物的标本片。

方法：取一片干净的载玻片放在试验台上，用一支滴管吸取试管中藻类培养液于载玻片的中央，用干净的盖玻片覆盖在液滴上（注意不要产生气泡）即成标本片，然后用低倍镜和高倍镜观察（教师示范）。

3、用压滴法观察原生动物和微型后生动物（制作方法同上）。

思考题

你一共观察到几种微生物，绘出他们的形态图。

实验三 微生物的染色 5

Ⅰ、细菌简单染色法

一、实验原理

细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。例如，美蓝(亚甲蓝)实际上是氯化亚甲蓝盐(methylene blue chloride，缩写为M B C)；它可被电离成正、负离子：

M B Cmethylene blue chloride-

带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫(crystal violet)、碱性复红(basic fuchsin)、番红(又称沙黄，safranine)等。

酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。

二、实验器材

1、 菌种 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus

cereus)；

2、 仪器 显微镜；

3、 材料 接种环，酒精灯，火柴，载玻片，洗瓶，废液缸，擦镜纸，吸水纸；

4、 染料 草酸铵结晶紫或石碳酸复红。

三、操作步骤

1、涂片 在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。

2、干燥 将涂片于空气中自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但 6 不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。

3、固定 手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次(用手指触涂片反面，以不烫手为宜)。待玻片冷却后，再加染料；

4、染色 玻片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)于菌膜部位，染l-2min。

5、水洗 倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。

6、干燥 自然干燥或用吸水纸 盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。

7、镜检 用油镜观察并绘出细菌形态图。

8、清理 实验完毕，擦净显微镜。有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后备用。

四、注意事项

1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。

Ⅱ、革兰氏染色法

一、实验原理

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。

该染色法所以能将细菌分为G菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。