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利用线粒体DNA上的cytB鉴定林蛙及林蛙油

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Vol.36 No.lJan. 2019第36卷第

1期

2019年1月吉林化工学院学报

JOURNAL OF JILIN INSTITUTE OF CHEMICAL

TECHNOLOGY

文章编号：1007-2853 （2019）01 -0052-06利用线粒体DNA±的cytB 鉴定林蛙及林蛙油

董 瑶-

钱元梅小，

宋 曼2*",常 迪2小，崔 浩

2宀

（1.吉林化工学院生物与食品工程学院，

吉林吉林

132022,2.吉林化工学院化学与制药工程学院，

吉林吉林

132022；

3.吉林化工学院吉林省农业资源综合开发与利用工程研究中心，吉林吉林132022）

摘要：目的：以线粒体DNA上cytB为研究对象,采用聚合酶链式反应（PCR

）

手段,建立林蛙及林蛙油鉴

定方法.方法:采用市售成年雌蛙的新鲜组织和林蛙油为实验材料，通过试剂盒提取总

DNA；

以已报道的

东北林蛙、中国林蛙、黑斑蛙和蟾蛛的

c

”B为模板，

设计四对引物;PCR

扩增产物回收测序.结果:仅东北

林蛙引物的PCR体系获得1 100 bp左右大小的产物,产物序列与东北林蛙cytB序列一致性为99%,说

明实验对象林蛙为东北林蛙，林蛙油来源为东北林蛙.讨论：利用mtDNA独特的优势，应用PCR扩增

cytB,并测序确定了林蛙品种，建立了林蛙种属以及林蛙油基源的鉴定方法，为林蛙油类药材的鉴定提 供科学理论依据.关 键 词：林蛙;林蛙油;cytB；DNA测序;鉴定

中图分类号：TQ64I 文献标志码：A DOI： 10.1

6039/j.cnki.cn22-1249.2019.01.011

林蛙在明、清时期作为贡品，

被列为宫廷“八

珍”之一.林蛙油又称哈仕蟆油、哈蟆油等⑷，是名

贵的中药材.林蛙油具有补肾益精、养阴润肺的功

效，中医用于治疗阴虚体弱

、神疲乏力、心悸失眠、

盗汗不止、劳嗽咳血等症国.现代研究表明，林蛙

油主要含有蛋白质和氨基酸、脂肪酸、激素和维生

素等成分，具有抗衰老、抗疲劳、降血脂、提高机体

免疫功能和增强应激性等作用⑶，林蛙油蛋白水 解得到的小肽还具有抗菌作用⑷.由于林蛙油价 格昂贵，市场上出现了诸多林蛙的假冒产品，如牛

蛙油、青蛙油、蟾赊油及淀粉、琼脂合成油等•林蛙

属有97个种,广泛分布于世界各地，在中国范围

内，林蛙在东北地区分布最多，主要有中国林蛙和

东北林蛙,而林蛙油为中国林蛙（大油）或东北林

蛙（

小油）

雌性输卵管的干制品.

线粒体DNA（ mtDNA

）

作为遗传信息的载体，

是研究动物起源进化及对群体进行遗传分析的理 想对象，由于mtDNA

为母系遗传

，线粒体中

cytB

进化速度适中，是分析种内、种间遗传多样性和进

化关系的适当的DNA

片段，

可应用于生物的分

类、

系统发育和遗传多样性的研究.cy

沼基因已被

广泛的动植物的系统发育以及种的鉴定研究中， 张丽华等采用PCR扩增cytB基因部分序列片段

结合的方法建立了中药利心丸中貂心的分子遗传 学鉴定方法⑸•邓莹等利用PCR扩增

cytB基因，

建立了龟甲类药材的鉴定方法0 •曲莉等在此基 础上,优化了 DNA提取和PCR检测方法,将所需

试剂组合成试剂盒,用其鉴定龟甲真伪⑴•曲萌等

建立类似的鉴定鸡内金药材的方法⑻•本文利用 mtDNA独特的进化优势，

通过PCR

扩增cytB,并

测序确定林蛙品种，建立林蛙种属以及林蛙油基

源的鉴定方法,为林蛙油市场保护提供鉴定方法，

为林蛙油类药材的鉴定提供科学理论依据.

1实验部分1.1试剂与仪器

1.1.1试剂

DNA提取试剂盒（

柱式提取试剂盒

）

；

TE缓

收稿日期:2018-09-17基金项目：吉林化工学院项目（2017017）

作者简介:董瑶（1988-），

女，吉林敦化人，吉林化工学院助教,硕士，主要从事功能食品方面的研究.

* 通信作者：崔浩,E-mail: cuihao 102@ 163.com**吉林化工学院2014级学生

* * *吉林化工学院2013

级学生第1期董

瑶

，等:利用线粒体

DNA上的

c”B

鉴定林蛙及林蛙油

53

冲液：5 mL pH 8.0 Tris • HC1 ( 1 mol/L)、1 mL pH

8.0 EDTA(0.5 mol/L)加入 400 mL ddH2O,定容至 500 mL,灭菌保存；lxTAE (pH8.5) ：4.84 g Tris、 0.75 g Na2EDTA • 2H20,800 mL 去离子水,溶解, 加入1.2 mL的醋酸，定容至1 L,室温保存；

6x

Loading Buffer：4.4 g EDTA、250 mg 漠酚蓝、250 mg 二甲苯氧FF于加入200 mL

去离子水，加热溶解，

加入180mL甘油，调节

pH至

7.0,再定容至

500

mL；蛋白酶K：德国Qiagen公司；脱氧核糖核昔三 磷酸(dNTP)、Taq酶、DNA回收试剂盒、DL2000 DNA Marker、

入-EcoT14 I digest等分子生物学试

剂:宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖:西班牙

Biowest公司；林蛙油:购自吉林省集安市；林蛙：

购自吉林省吉林市;引物：由南京金斯瑞生物科技 有限公司合成,RD-S: CAATACGTAAATTCCACCC ；

RD-AS： TTGTTTTCCAGGAGTCCTA； RC-S： GGCTT- GATGAAATTTTGGG； RC-AS： TATTGGGGATT-

GAGCGGAG；

PN-S： TGAAACTTCGGCTCCCTCC ；

PN-AS： CGATTTGACCAATGGTGAT ； BR-S： TACT-

TCGTAAAACCCATCC； BR-AS： TCTGTTAAGGCGT-

GCTAGT.1.1.2仪器PCR仪,K90,德国耶拿分析仪器股份公司；

分析天平，FA-2004N,上海精细科技仪器有限公

司；凝胶成像系统，BIO-BEST 135A.SIM INTER­

NATIONAL ；

电泳槽

JY-SCZ2

+ ,

北京君意东方电

泳设备有限公司；电泳仪,JY-SCZ2 + ,北京君意东

方电泳设备有限公司；台式高速离心机，HC- 2154,安徽中科中佳科学仪器有限公司；微量移液

器，百得实验室仪器(苏州)有限公司.

1.2实验过程

1.2.1柱式试剂盒提取DNA

DNA提取参考文献[9],取25 ~ 50

mg新鲜的

研细的林蛙油或林蛙肉放入1.5 mL的离心管中，

力口 180 jjiL Buffer ACL 及 20 |jlL Proteinase

K,振荡

混合1 min,将离心管放入56 T恒温水浴1 h,每

20 min振荡离心管一次；水浴完毕后加20 “L

RNAsae,振荡混合，以去除RNA.加200 |xL Buffer

CL,振荡混匀；再加200 “

L

无水乙醇

，混合振荡.

将管中液体全部转入吸附柱,9 000 r/min离心

1 min,弃去滤液.加 500 p.L CW1 Solution,9

000

r/

min 离心 30 s,弃去滤液.加 500 jjlL CW2 Solution,

9 000 r/min,离心30 s后弃去滤液，吸附柱再次

9 000 r/min离心30 s,室温晾干残留的CW2 Solu-

tion.最后加入 50-200 |iL CE Buffer,静置

2 min,

12 000 r/min离心2 min,收集滤液,-30 °C保存 备用.1.2.2 PCR扩增目的基因

本实验对提取的总DNA

进行扩增

，采用四对

引物，即：RD-S/RD-RS ； RC-S/RC-RS ；

PN-S/PN-

RS；BR-S/BR-RS.扩增的具体条件见表1.

表1

PCR体系

试剂体积/|1LTaq Buffer10

dNTP(2.5 m mol/L)3.5引物-S1引物-AS

1

模板1ddH2

O

3

Taq酶0.5

1.2.3 DNA回收测序

按DNA回收试剂盒步骤进行回收

DNA,将

纯化后的DNA测序.

2结果与讨论2.1样品总DNA

提取

利用DNA提取试剂盒对林蛙油及新鲜林蛙 组织提取总DNA,

电泳检测结果如图

1，相对于新

鲜林蛙组织，林蛙油总DNA条带不明显,说明同 样条件下，新鲜组织提取总DNA较容易.

1 2 3

总DNA-------►19329bp

7743bp6223bp

4254hp3472bp2690bp1882bp

1•林蛙油总DNA；2.新鲜林蛙组织总DNA；3.A-EcoT14I digest图1林蛙油总DNA电泳图

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中国林蛙酒

中国林蛙酒

中国林蛙酒
“森涛”牌系列中国林蛙酒，采用四川浓香原浆酒、贵州酱香原浆酒为基酒，以小兴安岭林蛙油为主要原料，通过生物技术，经煮沸、复蒸、萃取、提纯、沉降等工艺配制而成。

最终呈现出高品质的中国林蛙酒原浆酒，是伊春市最具地方特色的酒中新贵。

林蛙在《本草纲目》中称之“山哈”，别名哈士蟆、雪蛤。

现今被命名为中国林蛙，其雌蛙输卵管的干燥物称之为“雪蛤油”，《中药大词典》记载：蛤蟆油具有独特的“补肾益精、润肺养阴”之功效。

《中国药物学》记载：蛤蟆油是“润肺、生津、补虚的身体增强剂，是身体衰弱的滋补佳品”。

明清时期，就已成为名贵滋补珍品，被誉为“八珍之首”，并作为“上等宫廷贡品”共达官贵人享用。

中国林蛙酒的主要添加成分是林蛙油，林蛙油富含 4 种激素、9种维生素、13种微量元素和18种氨基酸，具有极高的营养价值。

林蛙酒秉承林蛙油营养价值，又具酒的浓香，是风行的上等营养饮品。

森涛浓情容天下，蛙酒芬芳溢满杯。

这里初春，冰雪动融、杜鹃盛开；盛夏，千山盎然、百水争
秀；仲秋，层林尽染、姹紫嫣红；深冬，银装素裹、雪玉冰清。

伊春热情好客，独具特色的森林生态旅游以其原始、自然、粗犷、神奇而闻名遐迩。

最具特色的中国林蛙酒成为森林生态旅游的一道亮丽的风景，是馈赠亲友的上等佳品。

(精选)林蛙

(精选)林蛙

长白山林蛙一、林蛙简介一、、关于东北林蛙种级的确证及哈蟆油（雪哈油）作为名贵中药材原动物基源的考证。

长白山林蛙与东北林蛙系同物异名。

在动物分类学上属于脊索动物门（Chordata）、脊椎动物亚门（Vertebrata）、两栖纲（Amphibia）、无尾目（Anuraor Salientia）、蛙科（Ranidoae）、林蛙属（Rana）动物。

近几年，随着生物科学的进展，学术界众多专家学者从细胞、基因水平研究探讨林蛙属的分类，才真正地证明散布于中国东北长白山区域的中国林蛙其分类阶元为一有效物种级，即东北林蛙（Rana dybowskii Guenther），因其要紧散布于吉林长白山脉，故又习称长白山中国林蛙。

当以细胞学、分子生物学研究方式为技术平台，从细胞、基因水平进行比较才真正地揭露了生物体外观表态的调控因子。

其中国林蛙东北长白山居群的细胞核型的第7对染色体为m，而其它散布区域的中国林蛙那么为sm，除此之外，就其形态、生境、散布象限亦不同，而其细胞核型、C带、银染亦存在明显不同，据此各类不同足以说明中国林蛙东北长白山居群应为一独立的有效物种。

长白山中国林蛙，别名哈蟆、雪哈，是一种重要的野生经济动物，系名贵山珍、滋补佳品和美味佳肴与一身，举世闻名。

我国东北吉林长白山区是长白山中国林蛙（即学名东北林蛙）的原产地、主产区，其中尤以东北长白山脉桦甸林区盛产。

并以食用和药用历史悠长，质量之优而闻名于世。

我国最先记载长白山中国林蛙的史书为《本草图经》（宋·苏颂）和《本草纲目》（明·李时珍），距现今已有九百余年的历史，长白山中国林蛙（哈蟆、雪哈）自明代始即被封为朝廷贡品，被列为“关东三宝”，清朝时期被誉为“水陆八珍”之首，同时也与“飞龙”、“熊掌”、“猴头”并誉为“四大山珍”。

史书记载，哈蟆油（雪哈油）起初是在我国东北民间作为美味食物应用，后来在应用中发觉其具有显著的滋补强壮之功效，达到人所珍视的程度，以致成为名贵中药材和滋补保健品，现今其与长白山原生态野生人参、鹿茸并列，被誉为“东北新三宝”或“吉林新三宝”。

林硅油功效与作用都有哪些

林硅油功效与作用都有哪些

林硅油功效与作用都有哪些林蛙油含有大量的氨基酸，维生素，还有大量的性激素等，对于滋阴强肾等效果十分明显。

下面是店铺为大家带来的林硅油的功效与作用，欢迎阅读。

林硅油功效与作用延缓衰老、抗疲劳、滋阴养颜其含丰富蛋白质、氨基酸、微量元素、维生素和矿物质，对机体的生长发育、延缓衰老和健康强壮诸方面都有较强的促进作用。

林蛙油经充分溶胀后释放出的胶原蛋白质、氨基酸和核酸等物质，可促进人体特别是皮肤组织的新陈代谢，保持肌肤光洁、细腻，保持肌体的年轻态、健康态。

其含有丰富的胶原蛋白，与人体皮肤有较好的亲和力，极易被皮肤吸收，对防止手足皱裂、保湿、晒后修复、除皱、止痒、淡化色斑、头发护理以及促进伤口愈合都有较好的功效。

提高机体免疫力功能和抗应激能力提高机体免疫力功能和抗应激能力并能明显提高巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，清除自由基，增强机体非特异性免疫功能和体液免疫功能，明显降低年感冒次数及减少其它疾病的发病率，使人远离亚健康状态。

调节改善冠心病连续口服该产品一个周期(2—3个月)后，能明显降低血脂、磷脂结构中的亲水性基团和亲油性基团，可以清除血管壁沉积的脂类物质、增强血液流量、改善微循环、对于调节改善冠心病、心律不齐等血管疾病及各种并发症有较好的效果。

补肾益精、润肺养阴补肾益精、润肺养阴。

对于病后、产后体质虚弱、肺痨咳血等症效果显著。

增强性功能增强性功能，提高和延长性兴奋期，对性功能有明显的改善。

对于调节更年期综合症有较好的效果。

改善病症可改善精血不足、神经衰弱、记忆力衰退、乳汁不足等症林硅油的作用介绍林硅油作用一：清理血垢林蛙卵油中的作用成分林蛙磷脂，可清理血液中的垃圾，溶解血管壁上的沉积物，增加其流动性和渗透性。

林硅油作用二：降低血脂林蛙卵油特有功效成分亚油酸、亚麻酸，可分解血液中的垃圾，分离血管壁上的有害附着物，降低甘油三酯、胆固醇、使血液清新正常。

林硅油作用三：畅通血脉林蛙卵油富含不饱和脂肪酸，可使血液垃圾自然排出体外，恢复血液流速，让心、脑、肝、肾等部位不缺血、不缺氧、不缺营养，俗称“血管清道夫”。

东北林蛙(Ranadybowskii)体表细菌分离鉴定及生境微生物分析中期报告

东北林蛙(Ranadybowskii)体表细菌分离鉴定及生境微生物分析中期报告

东北林蛙(Ranadybowskii)体表细菌分离鉴定及生境
微生物分析中期报告
中期报告内容如下：
1. 研究目的：分离并鉴定东北林蛙(Ranadybowskii)体表微生物菌群，探究其生境微生物组成及功能特点。

2. 研究方法：
(1) 采集东北林蛙样本，并从其体表上分离出细菌菌落。

(2) 对分离出的菌落进行鉴定及分类，其中包括菌落形态、染色、代谢途径、16S rRNA基因序列比对等方法。

(3) 利用生物技术手段分析分离出的菌群在东北林蛙身体各部位的分布情况，并获取菌群的谱系多样性及功能特点信息。

3. 研究进展：
(1) 已经完成东北林蛙样本的采集和分离工作，筛选出一些菌落供后续的实验分析，初步观察发现，这些菌落大多生长在林蛙的皮肤表面。

(2) 利用16S rRNA基因序列比对初步确认了分离出的一些菌群的类别，其中包括变异链球菌属、嗜酸杆菌属等多个属级分类。

(3) 利用PCR和文库构建技术，对东北林蛙多个部位的菌群进行了
高通量测序，并对测序结果进行了初步分析。

(4) 制定了后续实验的方案，包括对分离出的菌群进行功能研究、单菌培养与鉴定及菌群的代谢特征分析等。

4. 研究意义及预期结果：
(1) 通过对东北林蛙体表微生物组成的分析，深入探索了其在自然环境中的适应策略，为后续研究生物适应性提供了新的视角。

(2) 通过菌群的代谢特征分析，可以研究东北林蛙体内微生物的生物活性物质产生及其对蛙类生理功能的调节作用，为生物制药及医学应用提供新的思路和方法。

(3) 预期结果为深入揭示东北林蛙体表微生物组成及其功能，为进一步研究林蛙的生态与适应机制提高理论和实践指导。