5-无菌及微生物检查方法验证

⑴ 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控 结果不符合无菌检查法的要求。
⑵ 回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染 的因素；
⑶ 阴性对照管有菌生长。
⑷ 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物 生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌 操作技术不当引起的。
制备好的培养基应在2-25℃、避光保存； 保存在非密容器中，应在3周内使用；保 存在密闭容器中，可在1年内使用。
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培养基的适用性检查
无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支，培养14天应无菌 生长。试验可与无菌试验同时进行。
灵敏度检查
菌种 菌液制备 黑曲霉菌液的制备 培养基接种 参照中国药典2010版
真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼
可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至 千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单 细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（yeast）。多 细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。
药品污染常见的真菌
毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属 一、毛霉属（Mucor Micheli ex Fries） 毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并 引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。
无菌检查及微生物检查方法
介绍内容
一、微生物的基础知识 二、无菌检查方法
微生物基础知识
微生物（microorganism, microbe）是一些 肉眼看不见的微小生物的总称。 微生物（microorganism）包括细菌、支原 体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌 （霉菌、酵母菌和放线菌）等。
制备培养基的要求
⒈培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结 束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度 1/2。 ⒉培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5， 否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超 过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。 ⒊配制好的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
培养基的贮存
霉菌菌落形态
霉菌在孟加拉红培养基上的形态
酵母菌显微镜下形态
无菌检查法
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医 疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一 种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表 明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
试验环境 检验依据
无菌保障
隔离系统的应用
应用隔离系统重要的目的 ⒈是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操
阳性对照 根据供试品特性选择阳性对照菌： 无抑菌作用及抗革兰阳性菌 抗革兰阴性菌 抗厌氧菌 抗真菌 加菌量 结果判断
阴性对照
供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释 液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴 性对照不得有菌生长。
无菌检查法
包括薄膜过滤法和直接接种法。 只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。
薄膜过滤法
过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般 薄膜过滤器。 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性。
⒈可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂 供试品。
⒉水溶性供试品直接过滤。
⒊可溶性固体制剂供试品。
⒋装有药物的注射器供试品和具有导管的医 疗器具的供试品。
直接接种法
供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养 基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养 基量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体 积的10%。同时硫乙 醇酸盐培养基不得少于 15ml、改良马丁培养基不得少于10ml，培养基 用量和高度应经方法验证。
培养及观察
培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外 观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至 同种培养基或斜面上，培养细菌2天、真菌3天， 观察有无菌生长或镜检进行判断。 阴性对照不得有菌生长。
结果判断
⒈若供试品管均澄清，或虽显浑浊无菌生长，判 供试品符合规定。 ⒉若供试品中任何1管显混浊并确证有生长供试品 不符合规定。 ⒊除非能充分证明，检出的微生物非供试品所含。 ⒋当符合下列至少一个条件时，方可判复试。
和螺杆菌。 ⒋经革兰染色法（Gram stain）可将细菌分成两大
类：即革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）。
真菌（fungus；eumycetes）
是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道 的种超过10万个。大多是由纤细管状菌丝构成的 菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在 基质上生长的形态称为菌落。
根霉属（RhizopusEhrenberg）
根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食 品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。
曲霉属（Aspergillus）
曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚 有色物质，为有隔的多细胞。本属的 常见产毒霉菌有8个种，具有强烈的 致癌性。
青霉属
菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出， 无足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一 级分枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。 本属的常见产毒霉菌有9个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种 神经毒素，并具有致畸、致突变和致癌性；
结果判断
空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长 良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 试验同时应做空白对照
稀释液、冲洗液
0.1%蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜 的溶液作为稀释液、冲洗液。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭 菌后加入表面活性剂或中和剂等。
作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的 可靠性，实现一次检出的要求。 ⒉是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来 的污染。 隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境 的洁净度须符合无菌检查的要求。 日常检验还需对试验环境进行监控。
培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 0.5%葡萄糖肉汤培养基
细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其 特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式 繁殖。
细菌的形态
⒈细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观 察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百 倍至上千倍才能观察。
⒉一般以微米（µ m）作为测量单位。 ⒊在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌