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上转换荧光猝灭试纸条检测牛奶中磺胺喹恶啉

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上转换荧光猝灭试纸条检测牛奶中磺胺喹恶啉胡高爽，张燕，生威，李志，王俊平，王硕*（天津科技大学食品工程与生物技术学院，教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457）摘 要：目的：根据荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理，构建一种基于上转换荧光纳米材料的新型免疫标记荧光猝灭试纸条检测牛奶中的兽药磺胺喹恶啉（sulfaquinoxaline，SQX）残留。

方法：通过热分解方法合成上转换纳米荧光材料，通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金纳米颗粒。

将合成的上转换荧光颗粒固定在试纸条C线上，并将上转换荧光颗粒与SQX包被抗原的混合物固定在T线上，将胶体金标记的SQX单克隆抗体喷涂在金标垫上。

滴加样品后，随着样品液的流动，金标抗体会移动到T线处并与SQX包被抗原结合，这种结合会导致抗体上的纳米金颗粒（受体）与T线上的上转换颗粒靠近（供体），从而发生FRET，产生荧光猝灭。

在980 nm激发器激发波长下通过目测检测荧光强弱变化，从而实现对SQX的检测。

结果：该免疫荧光猝灭试纸条检测SQX的方法检测限为1 µg/L，牛奶样品的检测限为8 μg/L。

整个检测过程不超过15 min。

结论：该方法操作简便、灵敏度高、检测时间短、结果易于判断，可以满足牛奶中SQX残留的现场快速检测的要求。

关键词：磺胺喹恶啉；上转换材料；免疫荧光猝灭试纸条；牛奶Upconversion Nanoparticles (UCNPs)-Based Fluorescence Quenching Immunochromatographic Strips forRapid Detection of Sulfaquinoxaline in MilkHU Gaoshuang, ZHANG Yan, SHENG Wei, LI Zhi, WANG Junping, WANG Shuo* (Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)Abstract: Purpose: A novel fluorescent quenching immune chromatographic strip (FQICS) using upconversion nanoparticles (UCNPs) was developed to detect sulfaquinoxaline (SQX) in milk samples based on the principle of fluorescence resonance energy transfer (FRET). Methods: UCNPs was prepared using a pyrolytic process, and colloidal gold was prepared using sodium citrate reduction method. Then OVA-UCNPs were distributed to the upper side to form C line. OVA-UCNPs and SQX-OVA coating antigen were added to the lower side of the NC membrane to form the T line. When a negative sample was added to the sample pad, the liquid sample containing colloidal gold-labeled antibody migrated via capillary action toward the end of the strip. When the mixture reached the T line, which was coated with SQX-OVA coating antigen and OVA-UCNPs, the gold-labeled antibody bound to SQX-OVA coating antigen. Since the UCNPs were simultaneously coated at the same location as the SQX-OVA coating antigen, the binding of gold-labeled antibody to SQX-OVA coating antigen could provide a suitable distance between the UCNPs and colloidal gold to cause FRET. Using a 980 nm laser, the test results could be evaluated visually according to fluorescence intensity. Results: The limit of detection (LOD) of this assay for SQX in PBS buffer was 1 µg/L, and the LOD for SQX in milk samples was 8 μg/L. The whole detection process could be completed within 15 min. Conclusion: The FQICS based on UCNPs allowed for simple, sensitive, time-saving, and rapid on-site detection of SQX residues in milk.Key words: sulfaquinoxaline; upconversion nanoparticles; fluorescence quenching immune chromatographic strips; milkDOI:10.7506/spkx1002-6630-201724035中图分类号：TS201.2文献标志码：A文章编号：1002-6630（2017）24-0218-06引文格式：胡高爽, 张燕, 生威, 等. 上转换荧光猝灭试纸条检测牛奶中磺胺喹恶啉[J]. 食品科学, 2017, 38(24): 218-223.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201724035. 收稿日期：2016-12-22基金项目：国家国际科技合作专项（2014DFR30350）；天津市科技计划项目（14ZCDGNC00098）作者简介：胡高爽（1989—），女，博士研究生，研究方向为食品安全。

E-mail：hugaoshuang1989@*通信作者：王硕（1969—），男，教授，博士，研究方向为食品安全。

E-mail：s.wang@HU Gaoshuang, ZHANG Yan, SHENG Wei, et al. Upconversion nanoparticles (UCNPs)-based fluorescence quenching immunochromatographic strips for rapid detection of sulfaquinoxaline in milk[J]. Food Science, 2017, 38(24): 218-223. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201724035. 磺胺类药物具有广谱抗革兰氏阴性菌和阳性菌的活性、价格便宜、使用方便等特点，广泛应用在兽医临床及动物饲料添加剂等研究领域中[1-2]。

由于其在兽医临床应用时可能产生耐药性，而且会造成动物源性食品中出现兽药残留，进而对人体产生慢性的毒副作用，引起各种器官的病变，因此我国对肉类以及动物其他可食部分中磺胺类药物残留制定了最高限量[3-4]。

目前用于检测磺胺喹恶啉（sulfaquinoxaline，SQX）的方法主要包括毛细管电泳法[5-6]、气相色谱-串联质谱法[7-8]、高效液相色谱法[9-10]、液相色谱-串联质谱法[11-13]等。

上述方法虽灵敏度高，但因仪器昂贵，前处理步骤繁琐，耗费时间长等问题，并不适合进行大量样品筛查以及现场快速检测。

基于抗原抗体特异性反应的免疫分析检测技术因其具有灵敏、精确、快速、成本低廉等特点，在兽药残留的快速检测中得到了广泛的应用[14-17]。

 荧光纳米材料是一种新型材料，近年来得到了国内外科研人员的广泛关注，并作为一种免疫标记材料在免疫检测中得以应用[18-19]。

荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是一种对于相互靠近的供体与受体通过偶极子-偶极子相互作用而产生的非辐射性的过程，荧光猝灭是荧光能量共振转移的现象之一[20-22]。

本实验根据荧光共振能量转移的原理，构建了一种新型的基于上转换纳米材料（upconversion nanoparticles，UCNPs）和胶体金的免疫荧光猝灭试纸条检测牛奶中SQX。

UCNPs固定在试纸条C线上。

同时，上转换颗粒与SQX包被抗原（SQX半抗原与卵白蛋白（ovalbumin，OVA）复合物，SQX-OVA）固定在试纸条T线上，胶体金标记的SQX抗体喷涂在金标结合垫上。

当滴加阴性样品后，样品液带动金标抗体到T线处与SQX-OVA结合，这种结合导致抗体上的金颗粒（受体）与T线上的上转换荧光颗粒靠近（供体），从而发生FRET，产生荧光猝灭，实验原理如图1所示。

当滴加阳性样品后，游离SQX与金标抗体结合，从而使得T 线处的金标抗体与SQX-OVA的结合量减少，从而导致T 线上的荧光猝灭现象减少，会部分荧光保持，加入足量的阳性样品后，T线完全不产生荧光猝灭，会全部荧光保持。

这样目标物SQX与T线的荧光强度会产生一个正比的关系。

ṧ㔃н SQXSQX㜦փ䠁UCNPs OVA SQX SQX-OVA Anti-SQX փ≤㛼NC㟌T㓯T㓯T㓯T㓯C㓯ABCA.试纸条的组装示意图；B.添加阴性样品后由于FRET作用，从而使T线荧光猝灭；C.添加足量阳性样品后，金标抗体优先与结合垫样品中的SQX 结合，使得T线上的荧光不会猝灭，从而使得T线部分或全部荧光保持。

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上转换发光免疫层析法快速检测牛奶中雌二醇

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上转换发光免疫层析法快速检测牛奶中雌二醇姜会聪;任舒悦;王瑜;李巧凤;白家磊;彭媛;宁保安;孙思明;高志贤【摘要】建立定量快速检测雌二醇(E2)的上转换免疫层析技术.以上转换发光材料(UCP)为新型标记物,采用戊二醛法偶联单克隆抗体(mAb),制备UPT-mAb复合物,并以其作为探针,基于小分子竞争结合,建立免疫层析试纸条方法,并对试纸条性能进行评价.方法特异性强,稳定性好,灵敏度高,最低检出限低至2.75 ng/mL,线性范围为5 ng/mL～2 000 ngdmL,回收率88.88 ％～103.5％,变异系数CV＜10％.成功构建了上转换免疫层析法用于检测雌二醇,适用于现场快速检测,具有良好的经济价值和应用前景.%To develop an up-converting phosphor technology based immunostrip assay for quantitative detection of estradiol.A composition contained up-converting phosphor (UCP) as a novel lable and estradiol antibody (E2-mAb) with glutaraldehyde method.The estradiol was detected by the fluorescent immunostrip assay based on indirect competitive principle which had this composition as a probe.Detection performance including stability,specificity and sensitivity was evaluated.The method showed well stability,specificity and sensitivity with the detection limit of 2.75 ng/mL,the linear range of 5 ng/mL to 2 000 ng/mL,the recovery of 88.88 ％ to 103.5 ％,and the coefficient of variation (CV) less than 10 ％.The established assay for E2 detection can be successfully used to fast-field analysis and has good economic value and broad application prospect.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)003【总页数】5页(P119-123)【关键词】上转换发光材料;免疫层析;雌二醇;间接竞争【作者】姜会聪;任舒悦;王瑜;李巧凤;白家磊;彭媛;宁保安;孙思明;高志贤【作者单位】郑州大学公共卫生学院,河南郑州450001;军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室,天津300050;军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室,天津300050;郑州大学公共卫生学院,河南郑州450001;军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室,天津300050;军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室,天津300050;军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室,天津300050;军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室,天津300050;郑州大学公共卫生学院,河南郑州450001;军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室,天津300050【正文语种】中文雌二醇（Estrodiol，E2）是一种天然的雌激素，也是一种典型的内分泌干扰物，在自然界广泛分布。

基于上转换荧光纳米材料的有机磷农药检测方法的制作方法

基于上转换荧光纳米材料的有机磷农药检测方法的制作方法

本技术公开了一种基于上转换荧光纳米材料的有机磷农药检测方法，属于食品监测等技术领域。

该方法以六水硝酸钆、六水硝酸镱、六水硝酸铥、聚乙烯亚胺、氯化钠、氟化铵的乙二醇溶液为原料，通过一步溶剂热法合成了水溶性良好氨基修饰的上转换荧光纳米材料；然后向合成的上转换荧光材料水溶液中加入铜离子，孵育后，使荧光被有效猝灭；随后与乙酰胆碱酯酶和乙酰硫代胆碱碘化物溶液进行混合，构建稳态有机磷农药检测体系；加入不同浓度的目标分子农药后测定检测溶液的荧光强度信号特征值，以相对荧光强度为纵坐标，以农药浓度为横坐标建立该农药分子的检测标准曲线，最后对待测实际样品中的农药进行荧光测定。

技术要求1.一种基于上转换荧光纳米材料的有机磷农药检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，水溶性上转换荧光纳米材料的制备：将氯化钠和聚乙烯亚胺溶于乙二醇中，在常温下开始第一次搅拌，向上述混合物中加入六水合硝酸钆、六水合硝酸镱、六水合硝酸铥并持续第二次搅拌，当混合液颜色趋近澄清透明时，将溶于乙二醇的氟化铵加入上述混合物中，接着将上述溶液转移至高压反应釜中反应，自然冷却至室温后，离心收集沉淀，并用乙醇和去离子水洗涤沉淀三次，最后，将所得的沉淀干燥过夜；步骤二，特异性检测体系的构建：将步骤一得到的上转换纳米材料溶于去离子水中，得到上转换纳米材料溶液，然后与铜离子水溶液混合，第一次孵育后，使荧光被有效猝灭；随后在混合液中加入乙酰胆碱酯酶PBS溶液和乙酰硫代胆碱碘化物水溶液，第二次孵育后，得到上转换荧光纳米材料-铜离子-乙酰胆碱酯酶-乙酰硫代胆碱碘化物混合体系，即特异性检测体系；步骤三，目标农药分子检测标准曲线的建立：分别将不同浓度的农药加入到步骤三得到的特异性检测体系中，得到检测溶液，在激光器的激发下，利用上转换荧光光谱仪采集荧光光谱，以有机磷农药的浓度的对数值为横坐标，相对荧光强度信号特征值为纵坐标，建立目标待测农药分子的检测标准曲线；步骤四，实际抹茶样品中采用本方法进行有机磷农药的测定：将抹茶粉与乙腈溶液在离心管中混合，均质；然后将内容物离心，通过滤膜过滤；重复提取并合并提取物，将不同体积的二嗪磷储备溶液加标到上述预处理的抹茶提取物中，并使用旋转蒸发仪在氮气流下干燥以蒸发乙腈；然后将干燥的残留物溶于环己烷中，并加入到步骤三得到的特异性检测体系中，得到检测溶液，测定检测溶液的荧光强度信号特征值，代入步骤三得到的该农药分子的检测标准曲线，计算出实际样本中目标分子的含量，每个加标浓度重复三遍。

超高效液相色谱-串联质谱法测定调制乳中3种磺胺类药物残留

超高效液相色谱-串联质谱法测定调制乳中3种磺胺类药物残留


的上 清液 于鸡 心瓶 中备 用 。
１ ． ３ ． ３ 样 品 净 化
将提 取液 于 ５ ０℃ 旋 转蒸 发 至 ５ ｍＬ 以 下 ， 用 ６ ｍＬ １ ％乙酸水 溶液 分 两 次洗 涤鸡 心瓶 ， 将 洗 液 与 处
奶 中磺胺 药 物残 留进 行 检 测 ， 一 般 遇 到 磺胺 类 药物 残 留量超 标 ， 绝大 多数 是 由磺 胺 嘧啶 、 磺胺 甲基 嘧 啶
第 ８期
程 国栋 ， 等： 超 高效 液相 色谱一 串联质 谱法 测定调 制乳 中 ３ 种 磺胺 类药 物残 留
‘ ８ ９ ３・
（ Ｆ Ｄ Ａ） 以 及 日本 等 许 多 国 家 和 监 管 机 构 都 已 经 对 该 类 抗 生 素 在 牛 奶 中 的 残 留 限 量 做 了 明 确 规 定 。 目前 磺 胺 类 药 物 的 检 测 方 法 主 要 有 酶 联 免 疫 法 、
针对 调 制乳 中磺胺 类 药物残 留的检测 方法 报道 也很
少， 所 以 研 究 调 制 乳 中 磺 胺 类 药 物 残 留 检 测 方 法 非 常有必要 ， 也 具 有 实 际 意 义 。 乳 品 加 工 企 业 依 据 Ｇ Ｂ １ ９ ３ ０ １ — ２ ０ １ ０ （ （ 食 品 安 全 国家 标 准 生 乳 》 规 定 对 牛
１ ． ４ ． １ 色 谱 条 件
１ 实验 部 分
Ｉ ． Ｉ 主 要 仪 器
Ｕ Ｐ Ｌ Ｃ — Ｔ ＱＤ液相 色谱一 串联质谱 仪 ： 配有 电喷雾
离子（ Ｅ Ｓ Ｉ ） 源（ 美 国 Ｗａ ｔ ｅ ｒ ｓ公 司 ） ； Ｍｉ ｌ ｌ ｉ — Ｑ 超 纯 水
本研 究 主要 分析上 述 ３种磺 胺类 药物 。本 研究 成果 可 以作 为对 国家标 准 检 测 方 法 的 补 充 ， 以保 证 调 制 乳 中磺胺 类 药物处 于有 效 监 控 中 ， 为 消 费 者 的健 康
荧光免疫层析法快速测定牛奶中头孢氨苄残留量

荧光免疫层析法快速测定牛奶中头孢氨苄残留量

摘 要： 目的 采用荧光免疫层析法结合现场检测仪建立牛奶中头孢氨苄残留的快速定量检测方法。方法 利用
反向微乳技术合成稀土铕荧光纳米颗粒，与头孢氨苄单克隆抗体结合制备荧光检测探针，以头孢氨苄卵清蛋白全抗 原和羊抗小鼠抗体分别作为检测线和质控线制备免疫层析试纸条，结合现场检测仪建立牛奶中头孢氨苄残留的快速 定量检测方法。结果 试验结果表明，该方法对头孢氨苄的检测限为 0. 16 ng / ml，半数抑制浓度( IC50 ) 为 0. 6 ng / ml， 线性范围为 0. 16 ～ 5 ng / ml，标准添加回收率为 100% ～ 115% 之间，与头孢菌素类及青霉素等其他 12 种抗生素的交叉 反应率均 ＜ 0. 01% ，与 ELISA 方法比较，测定结果相关性良好。结论 本试验所建立的荧光免疫层析法快速检测牛 奶中头孢氨苄残留，具有简便、快速、灵敏、直观的优点，可用于抗生素残留的筛查，极具推广和应用价值。
参考文献［8］方 法 制 备 稀 土 铕 纳 米 颗 粒。取 0. 4 mg 荧光纳米颗粒（ 20 mg / ml，20 μl） ，以等体积 CB 混 匀，于 12 000 r / min 离 心 洗 涤 3 次，每 次 4 min，悬浮于 100 μl CB 中，加入 100 μl 醛基化 Dex 混匀，室温避光震荡反应 3 ～ 4 h，以 CB 洗涤、悬浮同 上； 加入经 CB 透析 12 h 的 CEX 单克隆抗体0. 1 mg 混匀，4 ℃ 震荡反应 12 h 以上。加入 NaBH3 （ CN） （ 终 浓度为 5 mmol / L） 于 4 ℃ 震荡反应 2 ～ 4 h，加入等体 积封 闭 液 （ 50 mmol / L Tris-HCl，pH = 7. 8，2% BSA， 4% 蔗糖） 封闭 12 h 以上，用洗涤液（ 50 mmol / L TrisHCl，pH = 7. 8 ） 离 心 洗 涤 3 次，悬 浮 于 保 存 液 （ 50 mmol / L Tris-HCl，pH = 7. 8，0. 9% NaCl，0. 2% BSA，0. 05% Tween-20） ，置于 4 ℃ 避光处储存备用。 1. 3 免疫层析试纸条的制备