建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究

建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究作者：姚锦爱黄鹏陈峰余德亿来源：《福建农业学报》2018年第02期摘要：为明确建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性，室内测定了温度、pH值、光照、碳氮源对病原菌生长和产孢量的影响，以及病原菌孢子的致死温度及时间。

结果表明：该病原菌生长及产孢最适温度为25℃、pH值为7、光照条件为12 h光暗交替、碳源为a-乳糖、氮源为NaNO2，病原菌孢子的致死温度及时间为55℃水浴5 min。

研究结果可为建兰茎腐病的有效防控措施的选择奠定基础。

关键词：建兰；茎腐病；尖孢镰刀菌；生物学特性中图分类号：S 436.8文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）02-190-05Abstract： Biological characteristics of pathogenic Fusarium oxysporum， which causes stem rot disease on Cymbidium ensiflium， were studied. Effects of temperature， pH， light， and carbon and nitrogen sources on the hyphal growth and sporulation of the pathogen were examined. In addition， the lethal temperature and time of F. oxysporum spores were determined. The results showed that the optimal conditions for the growth and sporulation of the pathogen were 25℃， pH 7， 12-h-L∶12-h-D exposure， lactose monohydrate for carbon， and NaNO2 for nitrogen. The lethality of the spores was 5 min in 55℃ water.The study provided reference for the effective control of stem rot on C.ensifolium.Key words： Cymbidium ensifolium； stem rot； Fusarium oxysporum； biological characteristics建兰Cymbidium ensifolium是兰科Orchidaceae兰属Cymbidium多年生单子叶草本植物，在我国民间有着悠久的栽培历史，植物学界以其主产地福建命名，是福建传统特色花卉及主要出口创汇花卉[1]。

现阶段，建兰在福建省的种植模式以设施栽培为主，随着种植面积的扩大和集约化栽培程度的提高，茎腐病的发生逐年加重，影响了建兰的生长发育和观赏、经济价值，做好该病的防控工作显得尤为重要，故需通过研究明确其发生及为害情况、病原菌种类及生物学特性、田间快速检测及防控策略等。

福建省农业科学院植物保护研究所花果病虫害生态调控课题组已在漳州、龙岩和三明等地建兰种植区实地调查了茎腐病的发生及为害情况，并对该病的病原菌进行了分离、纯化和培养，通过致病性测定及rDNA-ITS和actin（肌动蛋白）基因序列分析，证明病原菌为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum，这是该病原菌侵染导致建兰茎腐病在国内外的首次报道[4]。

本研究在此基础上，室内测定了温度、pH值、光照、碳氮源对该病原菌生长和产孢量的影响，以及病原菌孢子的致死温度及时间，以明确建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性，为有效防控该病害的发生与蔓延提供参考。

1 材料与方法1.1 供试材料建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F.oxysporum，从漳州、龙岩和三明等地建兰种植区采集的茎腐病病株中分离、纯化和培养得到，其ITS和ACT基因序列在GenBank上登录（登录号：KY798315、KY798316、KY798317和KY798318），菌株保存和活化均采用PDA培养基。

1.2 试验方法1.2.1 温度对病原菌生长和产孢量的影响参考姚锦爱等[3-4]的方法，取菌龄一致、直径5 mm的菌苔接种于PDA培养基平板（d=9.0 cm，下同）中央，后分别置于5、10、15、20、25、28、30、35和40℃等9个温度的培养箱中黑暗培养，每个处理3次重复；培养7 d后，用十字交叉法测定菌落直径[5]；再往每个处理的培养皿中加入10 mL无菌水，用灭菌玻片刮下分生孢子配制成孢子液，经3层纱布过滤后，用纽鲍尔（Neubauer）血球計数板在B203LEDTR型生物显微镜下观察、测定每个处理的产孢量。

1.2.2 pH值对病原菌生长和产孢量的影响取高压灭菌后的PDA培养基保温在50℃水浴中，经无菌操作用0.1 mol·L-1 HCl或0.1 mol·L-1 NaOH溶液将PDA培养基pH值调节成3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等9个酸碱度，每个处理3次重复，再倒平板；待平板冷却后接入菌龄一致、直径5 mm的菌苔，于25℃培养箱中黑暗培养7 d后，采用1.2.1的方法测定菌落直径和产孢量。

1.2.3 光照对病原菌生长和产孢量的影响取菌龄一致、直径5 mm的菌苔接种于pH值为7的PDA培养基平板，后分别置于完全光照（3 000 lx荧光灯）、完全黑暗和12 h光暗交替等3种光照条件的25℃光照培养箱中培养，每个处理3次重复；培养7 d后，采用1.2.1的方法测定菌落直径和产孢量。

1.2.4 碳源对病原菌生长和产孢量的影响采用真菌生理培养基（NaNO3 1.0 g、KH2PO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5 g、碳源5.0 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1 000 mL）为基础培养基，分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-果糖、a-乳糖、甘露醇和淀粉等为碳源，制成7种pH值为7的培养基平板[3]，以不加碳源为对照（CK），共8个处理，每个处理3次重复；在7种培养基平板和对照中，分别接入1块菌龄一致、直径5 mm的菌苔，再置于25℃的培养箱，12 h光暗交替培养7 d，后采用1.2.1的方法测定菌落直径和产孢量。

1.2.5 氮源对病原菌生长和产孢量的影响采用真菌生理培养基（氮源1.0 g、琼脂15.0 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、a-乳糖 5.0 g、蒸馏水1 000 mL）为基础培养基，分别以KNO3、NH4Cl、NH4NO3、NaNO2、赖氨酸等为氮源，制成5种pH值为7的培养基平板[3]，以不加氮源为对照（CK），共6个处理，每个处理3次重复；在5种培养基平板和对照中，分别接入1块菌龄一致、直径5 mm的菌苔，再置于25℃的培养箱，12 h光暗交替培养7 d，后采用1.2.1的方法测定菌落直径和产孢量。

1.2.6 病原菌孢子致死溫度及时间的测定以上述试验结果为条件培养病原菌7 d，后往培养皿中加入适量无菌水，在400倍生物显微镜下配制每视野20～30个孢子的悬浮液；取18个2 mL离心管，每管加1 mL孢子悬浮液，分别置于45、50、55℃的恒温水浴锅中5、10、15、20、25和30 min，后迅速将离心管再浸入4℃水中冷却，每个处理取60 μL孢子悬浮液于洁净载玻片上制成悬滴，放入培养皿一同置于25℃的光照培养箱中黑暗、保湿培养12 h，后将载玻片置于400倍生物显微镜下统计孢子萌发率（每处理统计300个孢子）。

1.3 数据统计与分析利用DPS 7.05数据处理软件的DMRT检验法，对该病原菌在不同温度、pH值、光照、碳源和氮源下的菌落直径和产孢量，以及病原菌孢子在不同高温及水浴时间下的孢子萌发率进行多重比较，分析差异显著性。

2 结果与分析2.1 温度对病原菌生长和产孢量的影响由表1可知，病原菌在5℃和40℃时无法生长，在其他7个温度时均能生长；病原菌在5、10和40℃时无法产孢，在其他6个温度时均能产孢。

生长速度以28℃最快，培养7 d后菌落直径可达85.30 mm，显著大于其他8个处理；其次是25℃和30℃，生长也较快，两者差异不显著；后依次是20、15、35和10℃，相互间差异显著。

产孢量以25℃最高，每皿达58.73×106孢子，显著大于其他8个处理；后依次是28、30、20、35和15℃，相互间差异显著。

综合评判病原菌的生长和产孢量，推定该病原菌培养的最适温度为25℃，在此温度下病原菌既能快速生长，又能获得最高产孢量。

2.2 pH值对病原菌生长和产孢量的影响由图1可知，病原菌在pH值3～11时均能生长和产孢。

生长速度以pH值6和7最快，培养7 d后菌落直径可达84.33和84.00 mm，两者差异不显著，但显著大于其他7个处理；其余依次为pH值5、8、9、4、10、11和3。

产孢量以pH 值7时最高，达59.77×106孢子·皿-1，显著大于其他8个处理；后依次是pH值6、5、8、9、10和4，相互间差异显著；pH值11和3较低，最多也仅4.63×106孢子·皿-1，显著低于其他处理。

可见该病原菌培养的最适pH值为7。

2.3 光照对病原菌生长和产孢量的影响由图2可知，病原菌在3种光照条件下均能生长和产孢。

生长速度和产孢量，均以12 h光暗交替最快和最高，培养7 d后菌落直径和产孢量分别达87.33 mm和58.57×106孢子·皿-1，均显著大于其他2个处理；其次是完全黑暗，最后是完全光照，两者差异显著。

可见，12 h光暗交替是保证病原菌生长及产孢的最适光照条件。

2.4 碳源对病原菌生长和产孢量的影响由图3可知，病原菌在7种碳源和对照（CK）中均能生长和产孢。

生长速度以a-乳糖最快，培养7 d后菌落直径可达60.33 mm，显著大于其他6个处理和对照（CK）；接着依次为麦芽糖、淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖和甘露醇；最后是对照（CK），显著小于其他处理。

产孢量也以a-乳糖最高，达37.97×106孢子·皿-1，显著大于其他6个处理和对照（CK）；接着依次为甘露醇、淀粉、蔗糖和葡萄糖、对照（CK）、麦芽糖和D-果糖。

可见a-乳糖是保证病原菌生长及产孢的最适碳源。

2.5 氮源对病原菌生长和产孢量的影响由图4可知，病原菌在5种氮源和对照（CK）中均能生长和产孢。

生长速度以KNO3最快，培养7 d后菌落直径可达59.67 mm，显著大于其他4个处理和对照（CK）；其余依次为赖氨酸、对照（CK）、NaNO2、NH4NO3、NH4Cl。