植酸对大肠杆菌抑菌机理的研究

江苏农业学报（Ｊｉａｎｇｓｕ　ｏｆＡｇｒ．Ｓｃｉ．），２０１２，２８（２）：４４３～４４７　４４３　

侯伟峰，谢晶，蓝蔚青，等．植酸对大肠杆菌抑菌机理的研究［Ｊ］．江苏农业学报，２０１２，２８（２）：４Ｊ４３４４７　

植酸对大肠杆菌抑菌机理的研究　

侯伟峰，　谢晶，　蓝蔚青，　朱军伟　

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海２０１３０６）　

摘要：　为了研究植酸对大肠杆菌的抑菌机理，测定了植酸对大肠杆菌的抑菌效果、最小抑菌浓度、细菌生长　曲线、菌液碱性磷酸酶（Ａ　）含量及电导率，并观察了细菌超微结构。结果表明，植酸对大肠杆菌有较强的抑菌效　果，且随着浓度的增大而增强，植酸对大肠杆菌的最低抑菌浓度（体积分数）为０．４％；与不添加植酸的对照相比，　植酸改变了大肠杆菌的生长规律，使细胞破损严重，细胞壁和细胞膜通透性增加，细胞质外渗，菌液中ＡＫＰ含量和　电导率增大。　关键词：植酸；大肠杆菌；抑菌机理　中图分类号：ＴＳ２０２．３　文献标识码：Ａ　文章编号：１０００－４４４０（２０１２）０２－０４４３－０５　

Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｐｈｙｔｉｃ　ａｃｉｄ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　

ＨＯＵ　Ｗｅｉ—ｆｅｎｇ，ＸＩＥ　Ｊｉｎｇ，ＬＡＮ　Ｗｅｉ—ｑｉｎｇ，ＺＨＵ　Ｊｕｎ－ｗｅｉ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＦｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆＡｑｕａｔｉｃ－ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ＆Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｏｃｅａｎ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１３０６，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｍｉｅｒｏｂｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｐｈｙｔｉｃ　ａｃｉｄ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ，ｍｉｎｉ—　ｍｕｍ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＡＨＣ），ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ，ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＫＰ）ｃｏｎｔｅｎｔ，ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉ—　ｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｕｌｔｒａｓｔｒｕｅｔｕｒｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｐｈｙｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ａ　ｓｔｒｏｎｇ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｙｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｔｈｅ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．　Ｔｈｅ　ＭＩＣ（ｖｏｌｕｍｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｗａｓ　０．４％．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏ　ｐｈｙｔｉｃ　ａｃｉｄ），ｐｈｙｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｃｈａｎｇｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ，ｄｅｓｔｒｏｙｅｄ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ．Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｄ　ｗａｌｌ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｌｅａｓｅｄ，ｔｈｅｎ　ＡＫＰ　ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｈｙｔｉｃ　ａｃｉｄ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　

植酸（Ｐｈｙｔｉｃ　ａｃｉｄ），淡黄褐色粘稠液体，又名肌　

醇六磷酸，是从植物种子中提取的一种有机磷酸类　

化合物，广泛应用于食品、化工和医学等行业　。　特别是在食品行业中，植酸因其抗氧化和高度络合　

收稿日期：２０１１－０７．１９　基金项目：“十二五”国家支撑计划项目（２０１１ＢＡＤ２４Ｂ０２）；上海市科　委工程中心建设项目（１１ＤＺ２２８０３００）；上海市教育委员会　重点学科建设项目（Ｊ５０７０４）　作者简介：侯伟峰（１９８６一），男，河南商丘人，硕士研究生，研究方向为　食品保鲜，（Ｔｅ１）０２１￣１９００３９５；（Ｅ－ｍａｉｌ）ｈｏｕｗｅｉｆｅｎｇｈａｐｐｙ　＠１６３．ｅｏｍ　通讯作者：谢晶，（Ｔｅ１）０２１＆１９００３５３；（Ｅ—ｍａｉｌ）ｊｘｉｅ＠ｓｈｏｕ．ｅｄｕ．ｃａ　金属离子的特性，常用作水产品、油脂食品、酒类、新　鲜果蔬等的护色剂、稳定剂及保鲜剂［２－３］；同时植酸　

还具有较好的抑菌作用，是一种安全、绿色、天然、新　

型的食品添加剂。　

目前，植酸在食品行业中的应用有了新进展。　

吴谋成等　研制了一种用植酸与其他物质复配的　

无毒绿色保鲜剂；张洪生　用植酸配制成了一种常　

温下嫩玉米保鲜剂，效果显著；王陆玲　利用植酸　

对草莓进行保鲜，与增效剂复合后，植酸可延缓果实　

中维生素ｃ的降解，较好地保持果实中的可溶性固　形物及含酸量。《食品添加剂卫生标准ＧＢ２７６０－－　

２０１１》　中允许植酸用于水产品。但关于植酸保鲜　江苏农业学报　２０１２年第２８卷第２期　

机理的报道较少。本试验选取自然界中常见的致病　

菌——大肠杆菌０１５７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７）　作为试验对象，研究植酸的抑菌机理，从而为植酸在　

食品保鲜上的应用提供理论支持。　

１材料与方法　

１．１试验材料与主要设备及试剂　试验材料：大肠杆菌０１５７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　

０１５７：Ｈ７，上海海洋大学微生物实验室保存。　主要设备：Ｓ－３４００Ｎ扫描电子显微镜、日立Ｅ．　

１０１０离子溅射仪、ＨＣＰ－２临界点干燥仪（日本Ｈｉ．　ｔａｃｈ公司产品）；ＵＶ一３０００　ＰＣ型紫外可见分光光度　

计（上海美谱达仪器有限公司产品）；ＳＧ３电导率仪　

［梅特勒．托利多仪器（上海）有限公司产品］；Ｓｔａｔ　ｆａｘ－３２００酶标仪（美国Ａｗａｒｅｎｅｓｓ公司产品）；ＴＨ２—　

８２（Ａ）气浴恒温振荡器（金坛市科稀仪器有限公司　产品）；Ｚ３６ＨＫ大容量高速冷冻离心机［德国哈默　

（Ｈｅｒｍｌｅ）公司产品］；ＸＷ一８０Ａ旋涡混合器（上海青　浦沪西仪器厂产品）；ＹＸＱ—ＬＳ一３０ＳＨ全自动立式压　

力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂　产品）；ＤＨＰ－９１６２型电热恒温培养箱（上海一恒科　技有限公司产品）；洁净工作台（苏净集团苏州安泰　空气技术有限公司产品）；电热鼓风干燥箱（上海一　

恒科学仪器有限公司产品）；一次性无菌针筒、０．２２　Ｉｘｍ水系微孑Ｌ滤膜、牛津杯［外径（７．８２±０．１０）　

ｍｍ］、游标卡尺等。　主要试剂：胰蛋白胨大豆肉汤（ＴＳＢ）、胰蛋白胨　

大豆琼脂（ＴＳＡ）、平板计数琼脂（北京陆桥技术有限　责任公司产品）；植酸（５０％高纯度植酸液体，食品　

级，浙江桐乡鑫洋食品添加剂有限公司产品）；碱性　磷酸酶（ＡＫＰ）试剂盒（南京建成科技有限公司产　

品）；２．５％戊二醛水溶液（ＡＲ级，上海凌峰化学试　剂有限公司产品）；无水乙醇、醋酸乙戊酯、ＰＢＳ磷酸　

缓冲液（ＡＲ级，国药集团化学试剂有限公司）。　１．２试验方法　１．２．１　菌种的活化　配制的ＴＳＢ液体培养基经　１２１　ｃ（＝灭菌１５　ｍｉｎ后，冷却，接种大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）　

后于３７　ｏＣ、１５０　ｒ／ｍｉｎ条件下培养２４　ｈ。取菌液进　行平板划线培养，挑取生长状况较好的单个菌落进　

行液体培养基扩增。　

１．２．２　植酸溶液的配制　配制体积分数为４％的　植酸水溶液，经０．２２　ｍ的微孔滤膜进行过滤灭　菌　后作为母液，用无菌水将母液稀释成体积分数　为２．００％、１．００％、０．８０％、０．４０％、０．２０％、０．１０％、　０．０５％的植酸溶液备用，对照组（ＣＫ）以无菌水代替　

植酸溶液。　

１．２．３植酸对Ｅ．ｃｏｌｉ的抑菌效果试验及最低抑菌　浓度的测定将活化后的Ｅ．ｃｏｌｉ转接到装有８　ｍｌ　

ＴＳＢ的试管中，于３７　ｏＣ、１５０　ｒ／ｍｉｎ摇床内培养８　ｈ　后，用ＴＳＢ梯度稀释菌液至细菌总数ｌ０。一１０　

ＣＦＵ／ｍｌ，利用涂布方法制成含菌平板。在无菌条件　下，参考倪清艳等　的方法，利用牛津杯方法进行　植酸抑菌效果的试验。同时取稀释好的该菌液０．５　

ｍｌ与等体积的不同浓度植酸溶液混合，使其最终体　积分数分别为４．００％、２．００％、１．００％、０．８０％、　

０．４０％、０．２０％、０．１０％、０．０５％，在３７　ｏＣ、１５０　ｒ／ｍｉｎ　的摇床内培养１６　ｈ后，将其完全倒入相应的培养皿　

中。采用倾注法倒入灭菌的平板计数琼脂培养基，　于３７℃条件下培养２４　ｈ后，根据各平板菌落生长　

情况，以不长细菌的最低浓度作为植酸的最低抑菌　

浓度，每个梯度做２个平行试验。对照试验：用无菌　水与菌液混合。　１．２．４植酸对Ｅ．ｃｏｌｉ生长曲线的影响将活化后　

的细菌转接到ＴＳＢ培养基中培养至对数期，用ＴＳＢ　稀释至菌落总数为１０　ＣＦＵ／ｍｌ。取菌液５　ｍ１分别　

与用ＴＳＢ稀释的植酸溶液等体积混合，使植酸最终　浓度为１倍和１／２倍最低抑菌浓度，于３７　ｏＣ、１５０　

ｒ／ｍｉｎ摇床内培养。分别在培养０　ｈ、０．５　ｈ、１．０　ｈ、　

２　０　ｈ　４　０　ｈ　６　０　ｈ　８．０　ｈ　１０　０　ｈ　１２　０　ｈ　１４．０　ｈ　１６．０　ｈ、１８．０　ｈ、２０．０　ｈ、２４．０　ｈ时取样，用分光光度　计在６３０　ｎｍ处测定菌液ＯＤ值¨　，重复３次。　

１．２．５植酸对Ｅ．ｃｏｌｉ菌体细胞壁的影响将培养　至对数期的菌液用ＴＳＢ调至１０。ＣＦＵ／ｍｌ，取菌液５　

ｍ１分别与植酸溶液等体积混合，使植酸最终浓度为１　倍和１／２倍最低抑菌浓度，３７　ｏＣ、１５０　ｒ／ｍｉｎ条件下培　

养。分别在培养０　ｈ、０．５　ｈ、１．０　ｈ、２．０　ｈ、３．０　ｈ、４．０　ｈ、　５．０　ｈ、６．０　ｈ时取菌液于３　５００　ｒ／ｍｉｎ条件下离心１０　ｍｉｎ。取上清液依照碱性磷酸酶（ａｒ，ｅ）试剂盒说明书　

的要求测定ＡＫＰ的含量　，以ＡＫＰ含量的变化反映　植酸对细菌细胞壁的影响情况，重得３次。　

１．２．６植酸对Ｅ．ｃｏｌｉ菌体细胞膜通透性的影响　将培养至对数期的菌悬液用ＴＳＢ培养液调至１０　ＣＦＵ／ｍｌ，取菌液５　ｍ１分别与等体积植酸溶液混合，使　

植酸最终浓度为１倍和１／２倍最低抑菌浓度，３７℃、

　侯伟峰等：植酸对大肠杆菌抑菌机理的研究　

１５０　ｒ／ｍｉｎ条件下培养。分别在培养０　ｍｉｎ、１０　ｍｉｎ、２０　ｍｉｎ　４０　ｒａｉｎ　６０　ｍｉｎ　１２０　ｍｉｎ、１８０　ｍｉｎ　２４０　ｍｉｎ、３００　ｍｉｎ、３６０　ｍｉｎ时取样，参考Ｌｅｅ等¨　的方法测定培养　

液的电导率值，用无菌水代替植酸溶液作为对照。　１．２．７植酸对Ｅ．ｃｏｌｉ菌体超微结构的影响　参照　

文献［１３．１５］的方法，取生长至对数期的Ｅ．ｃｏｌｉ菌　液５　ｍｌ，与等体积植酸溶液混合，使其最终浓度为１　

倍最低抑制浓度，３７℃、１５０　ｒ／ｍｉｎ条件下培养１０　ｈ。　取１．５　ｍｌ上述处理后的菌液于２　ｍｌ离心管中，　６　５００　ｒ／ｍｉｎ离心４　ｍｉｎ，弃上清，菌体用ＰＢＳ清洗１　次。２．５％戊二醛固定后，于４　ｃｃ冰箱内过夜。