谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）试剂盒使用说明
产品简介：
GOGAT和谷氨酰胺合成酶共同构成GS/GOGAT循环，参与氨同化的调控。GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；同时NADH氧化生成NAD+，340nm 吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。
试验中所需的仪器和试剂：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
产品内容：
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体20mL×3瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×3支，4℃保存；
试剂三：粉剂×3支，4℃保存；
试剂四：粉剂×3支，-20℃保存。
工作液的配制：临用前取试剂一、试剂二、试剂三和试剂四各一支，将试剂二、三、四转移到1瓶试剂一中混合溶解。这样可以分三批配制工作液并且测定，防止工作液失效。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400
μL提取液的比例充分匀浆以破碎并裂解细胞；8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
2、称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤：
取1mL工作液和0.1mL样本于1mL比色皿中，加样本的同时开始计时，在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃或25℃水浴中（哺乳动物用37℃，非哺乳动物用25℃），准确反应5分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，记录5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。
注意事项：
1、用蒸馏水调零。
2、测定期间样本和工作液在冰上放置，以免变性和失活。
3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
GOGAT活性计算：
1、组织中GOGAT活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol/L的NADH定义为一个酶活力单位。
GOGAT（U/mg prot）=354×ΔA÷蛋白浓度（mg/mL）
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol/L的NADH定义为一个酶活力单位。
GOGAT（U/g mass）=354×ΔA÷样本鲜重（g/mL）
2细菌或培养细胞中GOGAT活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol/L的NADH定义为一个酶活力单位。
GOGAT（U/mg prot）=354×ΔA÷蛋白浓度（mg/mL）
（2）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol/L的NADH定义为一个酶活力单位。
GOGAT（U/104cell）=354×ΔA÷细菌或细胞密度（104/mL）
