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蛋白质SDS-PAGE电泳实验常见问题及改进措施

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聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ｐｌｏｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＰＡＧＥ）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳技术，常 用作蛋白 质 分 离 鉴 定［１］。聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 由 丙 烯 酰 胺 单 体 （Ａｒｃ）和交 联 剂 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 （Ｂｉｓ）在 催 化 剂 过 硫 酸 铵 （ＡＰＳ）和加速剂四甲基乙二胺 （ＴＥＭＥＤ）的作用下聚合而成。 十二烷基硫酸钠（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，ＳＤＳ）是一种阴离子蛋 白质变性剂，它能 破 坏 蛋 白 质 分 子 内 和 分 子 间 的 氢 键，并 且 覆 盖在其表面，各亚 基 在 从 电 场 负 极 向 正 极 端 泳 动 时，其 迁 移 率 主要取决于分子量的大小［２］。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓａｎｅｘｔｒｅｍｅｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｓａｃｏｍｍｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｐｕｒｉｔｙ，ａｓｓｅｓｓｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｓｗｅｌｌ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｓｏｌｖｅｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓｏｆｇｅｌｌｅａｋａｇｅ，ｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｊｕｄｇｍｅｎｔ，ｌｏｎｇｄｅｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｔｉｍｅ，ａｎｄｕｓｅｏｆｍｅｔｈａｎｏｌｄｕｒｉｎｇＳＤＳ－ＰＡＧＥｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｓｏｍｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓｓｕｃｈａｓｕｓｉｎｇｗｈｉｔｅ ｔｉｐｔｏｓｏｌｖｅｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆｌｅａｋａｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇａｃｏｎｔｒｏｌｇｅｌｔｏｊｕｄｇｅｔｈｅｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｌ，ａｓｗｅｌｌａｓｒｅｐｌａｃｉｎｇｔｈｅ ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＲ２５０ａｎｄｍｅｔｈａｎｏｌｗｉｔｈＧ２５０ａｎｄｅｔｈａｎｏｌｗａｓｐｒｏｐｏｓｅｄ．Ｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｄｍｅｔｈｏｄｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ ｓｈｏｒｔｔｉｍｅ－ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ，ｌｅｓｓｕｓｅｏｆｔｏｘｉｃｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄｉｓｍｏｒｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｃｌａｓｓｔｅａｃｈｉｎｇ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ；ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｉｎｉｎｇ；ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＧ－２５０
１ 存在的问题
１．１ 凝胶制备过程中易渗漏
笔者实验室使用的 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳设备为北京六一生物 科技有限公司 ＤＹＣＺ－２４ＤＮ电泳仪，制胶时将厚薄两块玻璃板 （其中厚板左右两侧有突起约 ２ｍｍ的磨砂边）对齐放入专用制 胶模型中，但由于 玻 璃 板 左 右 两 侧 的 凸 起 磨 砂 边 密 封 性 较 差， 也没有弹性垫托底，为弥补这些不足，厂家设计了一条 Ｕ形橡 胶条将底部和磨 砂 边 的 外 侧 全 部 兜 住，形 成 一 个 左、右 和 底 部 均不漏液的密闭空间，未凝固胶液从顶部加入。该设备相对便 宜，但凝胶模型的组装难度更大，新手一般很难把握。
第 １６期
杜照奎，等：蛋白质 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳实验常见问题实验常见问题及改进措施
杜照奎，徐慧君，柯世省
（台州学院 生命科学学院，浙江 台州 ３１８０００）
摘要：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳是检测蛋白质纯度和评估蛋白质分子量的常用方法，也是一项极其重要的生物化学实验技术。本文针对 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳实验过程中凝胶渗漏、凝固时间不易把握等问题，以及染色、脱色耗时长且需使用甲醇等缺点，提出巧用白吸头解决漏胶问 题，设立对照判断凝胶是否凝固，用考马斯亮蓝 Ｇ２５０代替 Ｇ２５０，用乙醇代替甲醇等改进措施。改进后的方法具有耗时短、少用有毒试 剂、效果好等特点，比较适宜于课堂教学。 关键词：聚丙烯酰胺凝胶；电泳；蛋白质染色；考马斯亮蓝 Ｇ－２５０ 中图分类号：Ｏ６５８．９；Ｏ６２９．７３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０１９）１６－０１３５－０２
ＣｏｍｍｏｎＰｒｏｂｌｅｍｓａｎｄＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓｏｆＳＤＳ－ＰＡＧＥＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎ
ＤｕＺｈａｏｋｕｉ，ＸｕＨｕｉｊｕｎ，ＫｅＳｈｉｓｈｅｎｇ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＴａｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｚｈｏｕ３１８０００，Ｃｈｉｎａ）
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ可根据蛋白质的分子量大小，配制不同浓度的 凝胶，从而调控凝 胶 的 孔 径 大 小，可 使 不 同 分 子 量 的 蛋 白 质 得 以分离。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ具有设备相对便宜、样品用量少、操作相 对简便和重复性 好 等 优 点；而 且 该 技 术 分 辨 率 高，在 很 多 情 况 下，优于常用的层 析、超 速 离 心 及 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ［３］；此 外，该 技术 不 仅 能 分 离 蛋 白 质，还 能 分 离 核 酸［４］等。总 之，ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ技术广泛地应用于生物大分子的分离、鉴定、检测、定性 和定量分析等领 域，在 生 化 技 术 中 占 有 十 分 重 要 的 地 位，因 此 许多高校生物类相关专业均开设 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳实验。
１．２ 凝胶时间判断不准
一般而言，２ｈ对分离胶和浓缩胶凝固都是足够的。然而， 为了缩短凝胶时 间，提 高 实 验 效 率，分 离 胶 倒 入 双 层 玻 璃 板 夹 缝后，通常会在胶面顶端加一层去离子水以隔绝空气。而我们 在判断胶体是否凝固时，常用的方法就是缓慢抬起制胶模型的 一侧进行观察。这种操作虽然直截了当，但由于去离子水的存 在，抬起的角度通 常 也 会 比 较 大，易 对 尚 未 凝 固 的 凝 胶 产 生 扰 动，可能会进一步 增 加 凝 胶 时 间，甚 至 造 成 凝 胶 困 难；另 外，扰 动也可能导致局部凝胶浓度不均匀，影响电泳分离效果。
然而，实验开展过程也存在一些问题。如初学者制胶容易 出现渗漏现象，凝 胶 时 间 长 短 不 易 把 握；染 色 液 气 味 刺 激 和 脱 色时间长等。为提高学习效率，使学生尽量在课内完成实验并 观察到结果，同时 减 少 试 剂 对 学 生 呼 吸 系 统 的 刺 激，笔 者 针 对 以上常见问题进行了改进，取得了较好的效果。

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如何解决蛋白质稳态技术实验中的凝胶问题

如何解决蛋白质稳态技术实验中的凝胶问题

如何解决蛋白质稳态技术实验中的凝胶问题蛋白质稳态技术是一项重要的实验技术，可用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用等方面。

然而，在进行蛋白质稳态技术实验时，常常会遇到凝胶问题。

凝胶问题包括凝胶制备不均匀、凝胶破裂等情况，这些问题会影响实验结果的准确性和重现性。

因此，解决蛋白质稳态技术实验中的凝胶问题至关重要。

解决蛋白质稳态技术实验中的凝胶问题，首先应重视凝胶制备的过程。

凝胶制备是蛋白质稳态技术实验的第一步，影响着实验结果的可靠性。

在进行凝胶制备前，需要准备好所有必要的试剂和设备，并按照实验方法的要求，精确称取所需的试剂。

此外，应严格按照实验方法的步骤进行操作，避免因操作不当而导致的凝胶问题。

例如，在聚丙烯酰胺凝胶的制备过程中，应避免气泡的产生，可通过在制备过程中缓慢搅拌样品溶液，将溶液倒入凝胶板时避免产生气泡，以及使用凝胶夹具固定凝胶板等方法来解决凝胶制备中的问题，确保凝胶的均匀性和完整性。

其次，在选择凝胶类型时，应根据实验的要求和样品的性质进行合理选择。

蛋白质稳态实验中常见的凝胶类型有聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等。

聚丙烯酰胺凝胶主要用于分离和纯化蛋白质，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分析蛋白质的大小和相对丰度。

在选择凝胶类型时，应依据实验的目的和样品的特性来选择合适的凝胶类型，以提高实验结果的可靠性。

另外，在实验中合理调整凝胶的组成和浓度也是解决凝胶问题的重要方法之一。

蛋白质稳态实验中常使用的凝胶成分有聚丙烯酰胺和缓冲液等。

聚丙烯酰胺是一种常见的凝胶成分，可通过改变聚丙烯酰胺的浓度来调节凝胶的孔径和电泳速度。

在实验中，可以根据样品的大小和分子量范围等因素，选择合适的聚丙烯酰胺浓度，以获得较好的分离效果。

此外，调整缓冲液的pH值和离子浓度等参数也可以影响凝胶的性能。

例如，增加缓冲液中的胶缓冲剂浓度可增加凝胶的硬度，防止凝胶破裂。

除了上述方法外，合适的电泳条件也会对凝胶问题的解决起到重要的作用。

SDS-PAGE常见问题

SDS-PAGE常见问题

蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围15 ％ 15～45 kDa12.5％ 15～60 kDa10 ％ 18～75 kDa7.5％ 30～120kDa5 ％ 60～212kDa来源于《蛋白质技术手册》汪家政每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。

下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用<br />至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。

所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。

做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。

创新参选：SDS-PAGE的两点改进-SDS-PAGE配胶脱色创新-生物通

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创新参选：SDS-PAGE的两点改进-SDS-PAGE配胶脱色创新-
生物通
江苏大学的403实验室提出“改进一点点，我们能得到更加美观的SDS-PAGE胶”。

他们就SDS-PAGE凝胶电泳提出两点改进：改进一：配胶
背景：在配制SDS-PAGE胶的时候，加入分离胶的过程中常常会带入气泡，即使用双蒸水来压平界面也有可能因为力度不匀而导致胶面不够齐平，最后使跑出来的相同大小的蛋白条带不在同一个水平面上。

方法改进：所做的改进很简单却很有效，加完分离胶后，用移液枪吸取酒精（浓度没有特别要求，干净无污染就好）加到分离胶上至覆盖界面，静置片刻后放到37℃恒温箱中可加速胶的凝固。

待到分离胶完全凝固之后倒去上层的酒精，就可以看到齐平漂亮的界面啦！
改进二：脱色
背景：给染色结束的SDS-PAGE胶脱色往往需要比较长的时间，否则会由于脱色不完全而导致条带不清晰，影响到拍照的效果。

方法改进：改进的方法很简单易行——取一张我们常常随身携带的面巾纸，打个结放入盛有脱色液的大培养皿里放到脱色摇床上，这样一来，原来过夜脱色达到的效果现在只需要短短的3、4个小时就可以轻松实现了。

PS：希望大家这个时候用的面巾纸是质量比较好不容易掉屑的...。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。

在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。

电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。