组蛋白提取方法

表观遗传之组蛋白修饰—组蛋白乙酰化解决方案

一、组蛋白乙酰化作用

越来越多的证据表明：组蛋白乙酰化在转录调控中的作用机制表现为：①组蛋白尾部乙酰基的加入，中和了组蛋白的电荷，弱化了组蛋白与DNA的相互作用，疏松了染色质结构，有利于转录的进行，②组蛋白的乙酰化可以为转录因子的招募提供特异性的锚定位点：③组蛋白乙酰化结合其他组蛋白修饰（甲基化，磷酸化、泛素化）形成组蛋白密码影响基因的转录。

二、组蛋白乙酰化修饰

蛋白乙酰化：在乙酰基转移酶的作用下，在蛋白质赖氨酸残基上添加乙酰基的过程。

组蛋白乙酰化：是一种翻译后修饰，多发生在核心组蛋白N一端碱性氨基酸集中区的特定赖氨酸残基，将乙酰辅酶A的乙酰基转移到赖氨酸的sNH3+中和掉1个正电荷。由组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰基转移酶(histone deacetylase，HDACs)共同决定。

重要性：通过研究组蛋白乙酰化和组蛋白脱乙酰化，研究人员可以对“组蛋白密码”有更多的了解，可以研发HDAC的药物，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂（HDACi）通常用作情绪稳定剂和抗癫痫药，最近已被用作可能的癌症，神经退行性疾病和炎性疾病的治疗方法。

三、组蛋白乙酰化相关研究工具

1.组蛋白提取试剂盒

在我们进行某项实验之前首先需要做很多的准备工作，比如组蛋白修饰实验，需要准备的是组蛋白。那么我们怎么来准备适合我们实验需要的组蛋白呢？取决于你用的提取试剂盒。比如OP-0006 EpiQuik Total

Histone Extraction Kit(100)：

适合从哺乳动物的细胞或者组织中提取总核心组蛋白(H2A, H2B, H3, and H4)，组蛋白提取物中的翻译后修饰（PTM）保持完整，因此可与Epigentek的组蛋白修饰测定试剂盒一起使用，或用于组蛋白甲基化，乙酰化，磷酸化，SUMO化，泛素化，瓜氨酸化和ADP-核糖基化研究。

2.组蛋白乙酰化定量试剂盒 组蛋白乙酰化，包括组蛋白H3和组蛋白H4，参与染色质结构的调节和转录因子向基因启动子的募集。量化乙酰化组蛋白的总水平或特定赖氨酸的水平将有助于阐明基因激活的表观遗传调控，并有助于开发针对HAT或HDAC的药物。

组蛋白修饰的研究方法

一、 背景

许多组蛋白的各种翻译后修饰（PTM （即甲基化，乙酰化，泛素化 和SUM化）发生在赖氨酸位点。虽然在被覆盖的组蛋白折叠域内发现 了少数的修饰位点，但是翻译后修饰在柔韧的 N-末端尾部区域却是相当 普遍的。许多组蛋白修饰能够调节染色质结构中重要的功能性变化，并 通过直接地改变染色质结构/动态变化或通过招募组蛋白修饰蛋白和 / 或核小体改构复合体来实现。

组蛋白翻译后修饰已经被发现能影响许多基于染色质的反应，包括 转录，异染色质的基因沉默和基因组稳定性。 由于能影响到整个转录程

序，与基因表达相关的修饰尤其具有特殊意义。在多种体外模型中，组 蛋白翻译后修饰代谢途径的缺陷与基因表达失调有关。 这在某些情况下

也与人类疾病相关，并已在免疫缺陷和各种人类癌症中得到验证。 因此,

组蛋白标志物是如何被调节的以及如何影响 PTM特异性结合蛋白的相

互作用将继续成为重大的研究领域。

确定组蛋白翻译后修饰的功能往往涉及到研究修饰的丰度和结合伴 侣。这里所描述的方法将对这些方面进行总结 ，其中包括了详述组蛋白 纯化方法、制备位点特异性修饰的重组组蛋白、基于多肽的 PTM结合蛋

白表征体系以及染色质免疫共沉淀样品不同分析手段的实验方案的总 结。

二、 组蛋白修饰的研究方法

① 细胞裂解

通过免疫印迹来检测组蛋白修饰时可以用经 SDSLaem m样品缓冲液 提取得到的全细胞裂解液。对于动物细胞株而言， 离心得到的细胞可以

直接在样品缓冲液中重悬并煮过后上样；然而需要注意的是，一些实验 方案中还会推荐在提取步骤后对样品进行超声处理。 除了碱性预处理步

骤是可选的以外，真菌蛋白提取物可以用同样的方式来进行准备。 然而, 如果实验上必须尽量减少样品处理时间的话该步骤是可以省略的。 只要

注明该步骤的省略以及后续实验样品均以同样方式处理即可。 提取之后

再通过离心除去样品中的不溶性组分， 将可溶性的全细胞提取物留在上

染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验方法

实验原理

染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体

内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状

态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。在活体细胞

中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超

声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段

把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片

段的特性。

仪器和试剂

真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、miracloth

37%甲醛，2M甘氨酸，ddH2O，剪切的鲑精DNA/protein A琼脂糖珠(Sant cruz)，

蛋白酶K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,无水

乙醇,

提取缓冲液1（EB1）:0.4M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；5mM β-ME；

0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstain A、Leupeptin、

Antipain、TPCK、Benzamidine）

• 提取缓冲液2（EB2）:0.25M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl2；

1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)

；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）

提取缓冲液3（EB3）：1.7M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.15%Triton X-

100；2mM MgCl2；5mMβ-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）

核裂解缓冲液（NLB）：50mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA；1%SDS；PMSF和

蛋白酶抑制剂混合物（同上）

ChIP稀释缓冲液（ChIP DB）：1.1%Triton X-100；1.2mM EDTA；16.7 mM

百泰派克生物科技

组蛋白甲基化修饰检测

组蛋白（Histones）是由H1、H3、H2A、H2B和H4五种蛋白组成的蛋白质，存在于真核生物体细胞的染色质中，因富含碱性精氨酸和赖氨酸而呈碱性，可与酸性的双螺旋DNA结合成DNA-组蛋白复合物。在甲基化转移酶的催化下，组蛋白的精氨酸和赖氨酸N末端可以发生甲基化。组蛋白甲基化可以调控基因转录，调控结果取决于甲基化残基和甲基化程度。因此，研究组蛋白甲基化的方式和程度具有重要的生物学意义。

组蛋白甲基化检测主要检测组蛋白是否发生甲基化以及发生何种甲基化，目前检测方法主要有传统的染色质免疫共沉淀（ChIP）、Western免疫印迹（Western Blot）、蛋白芯片以及新发展的基于质谱的检测方法等。

染色质免疫共沉淀法是将获得的染色质用超声波切割成小片段，再与甲基化组蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀，分离出免疫沉淀染色质中的DNA进行后续PCR分析，对该组蛋白甲基化修饰进行精确地基因定位。

Western免疫印迹法是将蛋白质样品进行聚丙烯凝胶电泳电泳（SDS-PAGE），再转移到含有特异性抗体的固相载体薄膜上，待检测的蛋白质样品与对应的抗体进行特异结合可以检测该蛋白样品是否发生甲基化或发生何种甲基化。

蛋白芯片技术是将目的蛋白质样品与以特异性抗体为探针的抗体芯片进行杂交，再通过特定仪器检测该蛋白样品是否发生甲基化。

液相色谱串联质谱法是将组织样品进行分离纯化以得到纯的组蛋白，再利用质谱进行后续分析，将质谱获得的数据信息进行处理分析，从而实现对组蛋白甲基化的高通量检测。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合nanoLC-MS/MS纳升色谱，提供组蛋白翻译后修饰分析技术服务，只需要将您的实验目的告诉我们并寄送样品，百泰派克提供包括蛋白提取、蛋白酶切、甲基化肽段富集、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析一站式服务。