一、实验名称：
重组DNA技术
二、实验目的：
1.了解掌握DNA重组技术理论基础；
2.掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法；
3.掌握连接产物的转化方法及操作；
4.掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法；
三、实验原理:
1.重组DNA技术
重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型的技术。它主要包括以下几个步骤：
①目的基因的获取：主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。cDNA文库是以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组DNA文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，因此称为基因组DNA文库。
②基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。分为克隆载体和表达载体。克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外
定点突变等。表达载体：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物。选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。
③目的基因与载体的拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。
④重组DNA分子导入受体细胞：将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞，主要有以下几种方法：a、转化：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程。b、转染：将外源DNA导入真核细胞的过程。c、感染：以λ噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。
⑤重组体的筛选：可通过遗传标记如抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）等直接筛选或是根据免疫化学法、酶联免疫检测法等进行间接筛选。
⑥无性繁殖转化子(含重组分子的受体细胞)
⑦目的基因的表达
2、质粒酶切及鉴定原理
限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA双链，形成一定长度的DNA序列。根据限制性内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA片段具有相同的末端结构，而且大多数的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。本实验采用的限制性内切酶是Bam HI 和Hind III。
对于DNA回收，回收的目的是为了纯化提取的质粒，以用于以后的分子
杂交、重组质粒的构建、序列分析等。目前常用的回收技术有：柱纯化回收法、电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、DEAE滤膜插片法等，其中柱纯化回收法、电洗脱法，经济节省，操作方便，对DNA回收效果好。本实验采用试剂盒回收（柱纯化回收法），其原理是采用凝胶裂解液融化凝胶，采用特殊的收集管收集DNA 后，漂洗液洗脱杂质，最后用洗脱液洗出DNA。
四、主要实验仪器：不同规格移液器、EP管、常规电泳仪、紫外灯、恒温水浴箱、常规台式离心机、恒温孵箱、CP3吸附柱、收集管、培养皿、酒精灯、玻璃涂布棒等。
五、主要实验试剂：
1. 酶切相关试剂：pUC18DNA、λDNA（TIANGEN, MD202）、Hind III（Thermo, ER0501）、Buffer R (10X) （Thermo, BR5）、BamHI（Thermo, ER0051）、BamHI-Lsp1109I Buffer (10X)（Thermo, B57）、pUC18-mir203 质粒DNA （老师提供）。
2.电泳相关试剂：琼脂糖、GoldView、1kb DNA Ladder（TIANGEN，MD111）、DNA电泳loading buffer（6X）（TIANGEN, RT201-01），电泳缓冲液。
3、凝胶DNA回收：小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（庄盟国际生物，ZP202）。
4. 重组体构建相关试剂：T4 DNA连接酶(Thermo, EL0014)、10X T4 DNA 连接buffer( Fermentas, 00044933)。
5. 转化相关试剂：感受态细胞（本实验用感受态细胞DH5α从公司购买）、LB培养基（老师提供）、含Amp琼脂糖平皿（老师提供）、质粒小量提取试剂盒（庄盟国际生物，ZP101）、ddH2O等。
六、实验步骤：
1. 载体pUC18和目的DNA酶切
（1）质粒DNA酶切反应体系：
反应条件：37℃恒温水浴，2hr；室温下放置等待连接。
（2）目的DNA酶切反应体系：
反应条件：37℃恒温水浴，2hr；
（3）质粒载体双酶切反应体系：
反应条件：37℃恒温水浴，2hr；
根据以上反应体系配制好后，瞬时离心后置于37℃恒温水浴锅中反应。
2.目的DNA酶切片段电泳鉴定
（1）配制1%琼脂糖凝胶：称取0.5克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到1 %琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5 μL GoldView。小心混匀并倒在制胶槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子。将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液，准备电泳。
（2）电泳：取20uL酶切后产物，加入4uL DNA电泳loading buffer混匀，上样20uL。恒压90V电泳40-60min。
（3）紫外灯下观察结果并切胶用于后续试验。
3.目的DNA凝胶条带切割及目的DNA回收
根据试剂盒说明书操作
（1）将单一的目的DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量，约0.3g。
（2）向胶块中加入3倍体积溶胶液（900 µl），55℃,水浴10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )离心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。（4）向吸附柱中加入600 μl 漂洗液W2 （使用前加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。（5）向吸附柱中加入500 μl 漂洗液W2，12,000 rpm (~13,400×g )离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
（6）将吸附柱放入收集管中，12,000 rpm (~13,400×g )离心 2 分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
（7）将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl 的洗脱缓冲液TE，12,000 rpm (~13,400×g )离心 1 分钟，收集DNA 溶液。4. 连接目的DNA和酶切后的质粒DNA
反应体系：
