鸡白介素18成熟肽基因原核表达及抗血清的制备

新疆农业大学学报　２００６，２９（１）：ｌ～４　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　

文章编号：１００７—８６１４（２００６）０１　０００ｌ　Ｏ４　

鸡白介素１　８成熟肽基因原核表达及抗血清的制备　

张海玲　，冉多良。，刘培欣　，闫丽辉　，曹殿军　

（１＿中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨　１５０００１；２．新疆农业大学动物　医学学院，鸟鲁木齐８３００５２）　

摘　要：　用ＰＣＲ技术从含鸡ＩＩ　一ｌ８全长基因质粒扩增出编码鸡ＩＩ　１８成熟蛋白基因，亚克隆于ｐＰＲＯＥＸ　ＨＴａ　原核表达载体上，重组质粒转化大肠杆菌感受态ＤＨ５ａ中，随机筛选到阳性重组质粒，经酶切和测序证实目的基　因止确克隆于表达载体。ＩＰＴＧ诱导，重组蛋白以包涵体形式表达。薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白　的２１．９５　，用ＮＩ－ＮＴＡ树脂纯化重组蛋白，免疫ＳＰＦ鸡制备抗血清。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果显示鸡抗血清可以很好地　和所表达的蛋白带特异结合。Ｅｌ　ＩＳＡ可以检测到较高的多克隆抗体效价，表明此蛋白具有良好的抗原性。　

关键词：克隆；表达；多克隆抗体　中图分类号：　Ｑ７８６　文献标识码：Ａ　

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｃｋｅｎ　Ｍａｔｕｒｅ　ＩＬ一１　８　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ａｎｄ　

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｔｓ　Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　

ＺＨ　ＡＮＧ　Ｈａｌ　ｌｉ＇ｎｇ　～，ＲＡＮ　Ｄｕｏ—ｌｉａｎｇ。，Ｉ　ＩＵ　Ｐｅｉ　ｘｉｎｇ　，ＹＡＮ　Ｌｉ—ＨＵｉ　，ＣＡ（）Ｄｉａｎ—ｊ　ｕｎ　

（１．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｉ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　

Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＡＳ，Ｈａｒｂｉｎ，１５０００１；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒ—　

ｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ，８３００５２）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｃｈｉｃｋｅｎ　Ｉｉ　１８　ｍａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ＩＩ　一１８　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｂｙ　ＰＣＲ，　

ａｎｄ　ｗａｓ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＰＲＯＥＸ　ＨＴａ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．　

ｃｏｌｉ　Ｉ）Ｈ５ａ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ　ａｔ　３７　Ｃ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｂｏｕｔ　２６　

ｋｕ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍＣｈｌＩ　一ｌ８　ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｆｏｒ　２　ｌ＿９５　９／６　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅ　ｍａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｃｋｅｎ　ＩＩ　一１　８　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　Ｎｉ—ＮＴＡ　ｒｅｓｉｎ．　

Ｔｈｅ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ　ＳＰＦ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｒａｉｓｅｄ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍＣｈｌＩ　１　８　ｉｎ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅａｃｔ　ｔＯ　ｐｒｏ　

ｒｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ．Ｅｌ　ＩＳＡ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｓａｔｉｓｆａｃｔｏ　

ｒｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　

ＩＩ　一ｌ８具有很强的免疫调节功能，能刺激Ｔｈｌ　细胞分泌ＧＭ—ＣＳＦ，ＩＩ　２及ＩＦＮ～丫，并促进Ｔｈｌ　型细胞增殖¨　，增强ＦａｓＩ　介导的Ｔｈｌ细胞　和　

ＮＫ细胞的细胞毒活性　。研究发现，其可通过调　

节ＩＦＮ　７的表达提高机体的免疫水平，从而达到预　

防和控制微生物感染，抑制肿瘤发生的目的　Ｉ。　

收稿日期：２００５—１２—１８　基金项目：国家自然科学基金（３０３６００６７）　通讯作者：曹殿军，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉａｎｊｕｎｃａｏ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｅｏｍ　２０００年，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等　第一次克隆出鸡的白介素　ｌ８全基因后，该细胞因子已经被多方面研究使用，　

Ｗｉｎｆｒｉｅｄ　Ｇ　Ｊ　Ｄｅｇｅｎ等　发现相比铝盐和几丁质佐　

剂，重组ＩＩ　一１８明显增强了梭菌属类毒素和新城疫　病毒抗原的抗体心答。认为鸡重组白介素ｌ８是一　种新型的、安全的免疫调节剂，有很好的应用前景。

　维普资讯 http://www.cqvip.com ２　新蛳农业大学学报　２００６年　

本研究在大肠杆菌中诱导表达ＩＩ　・ｌ８成熟从，　

并以纯化后的表达产物为抗原制备抗　清。应Ｊ｝Ｊ　

Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ和Ｅｌ　ＩＳＡ刘’制备的抗　清进行特芹　

活性检测，为进一步刮ｆ究鸡ＩＩ　１８真梭表达活性榆　

测奠定基础。　

ｌ材料与方法　

】．１　材料　

１．１．１　实验动物　

ｌ５日龄ＳＰＦ鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医　

研究所实验动物巾心提供。　１．１．２　菌种和质粒　

鸡白介索１８　ｌＡ　Ｋ重组质粒，ｐＰＲ（）ＥＸ　Ｈ　Ｆａ　

原核表达载体，Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ均为实验窒保俘。　１．１．３　试剂　

Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｉ）ＮＡ聚合酶、Ｉ）ＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ、　

ｐＭＩ）ｌ８－Ｔ克隆载体、Ｔ４　Ｉ）ＮＡ往接酶、限制性　切　

酶购自　．矗　物一Ｉ　程（大连）有限公司；Ｉ）ＮＡ凝胶　

收试剂盒购丁上海华舜科技股份有限公　；低分子　

量蛋白Ｍａｒｋｅｒ、ＩＩ　Ｉ、Ｇ购于宝　物ｆ　程（大连）钉ｔ限　公刮；辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡Ｉｇ（　抗体购自　

Ｓｉｇｍａ公司。　

１．１．４　引物的设计与合成　根据基因ＧｅｎＢａｎｋ巾已知的山介索１　８　长　

序列设计引物：　

上游ｒｊＩ物：５’一ＧＧＡ　Ｉ、ＣＣＧＣＣＴ＇Ｉ、Ｔ　Ｉ、（　ＴＡ八（　

ＧＡＴＡＡ八ＡＣＴ一３’　下游引物：５’（７（１７ＴＣＧＡＧＣＴＴ（　ｒｒＴ　Ｆ（；ＡＡ　Ａ（　ＴＧＡＡ【　３’　

＿在上游引物中引入＆ｒ　Ｒ　Ｉ酶切位点，下游引　

物引入Ｈｉｎｄ¨Ｊ酶切佗点　

１．２　方法　

１．２．１　ＰＣＲ扩增及表达载体的构建　

以本实验搴保存的鸡ＩＩ　一ｌ８伞长质粒作为　

ＰＣＲ反应的模板，扩增ｉｎｃｈ　ＩＩ　一ｌ８，经ＤＮＡ凝胶同　收试剂盒纯化，用段ｏＲ　ｌ和Ｈｉｎｄ　１１１酶切后啊收，　

阿将ｐＰＲ（）ＥＸ　Ｈ＇Ｉ、　载体也用同样的酶处理。取　

５．０　ｆ　Ｉ　外源片断与０．５　ｆｚＩ　线　载体　合，加入　

４．５　ｆ』Ｊ　连接酶充分　合，１　６　Ｃ作用２　Ｉ１，转化Ｉ）Ｈ５　

感受态细菌。随机挑取　个　落提取质粒，进｛　酶　切及ＰＣＲ初步举定　确后，进行序列洲定。　１．２．２　目的基因的表达及重组蛋白表迭量的确定　

将燎定为阳性的重组匝粒转化Ｅ．ｃｏｉｌ　Ｉ）Ｈ５　感受态细菌。Ａｍｐ　（１００　ｇ／ｍＩ　）筛选．挑取单个菌　落接种于２　ｎ１Ｉ　Ｉ　Ｉｊ培养基（Ａｍｐ，１００＃ｇ／ｍＩ　）中，　

３７　Ｃ振荡培养过夜。取ｆ　述培养物以１／１ＯＯ的比　

例接种于新鲜的ＬＢ培养基（Ａｍｐ，１００　ｐ．ｇ／ｍＩ　）中，　

３７　Ｃ振荡培养毛（）『＿）　…达ｏ．６～０．９，无菌取出　１　ｍＩ　菌澉作为诱导前对照；剩余凶液中加ＩＰＴＧ至　

终浓度为ｌ　ｍｍｏｌ／Ｉ　，３７　诱导培养，每隔ｌ　ｈ取样　

并测ＯＤ　离心收集凶体。加入２００　ｐ．Ｉ　ＰＢＳ洗　

涤葡体，１０　０００　ｒ／ｒａｉｎ，１０　ｒａｉｎ，洗涤３次后用　

ｌＯ（）“Ｉ　ＰＢＳ溶解后与等最２×ＳＤＳ　样缓冲液，充　

分混匀，煮沸５　ｍｉｎ后｝二样，以诱导前菌体和诱导　

的卒载体为对照，进行ＳＩ）Ｓ　ＰＡＧＥ电泳，经薄层扫　

描测定表达蛋白在　体总蛋白巾的含量。　

１．２．３　重组蛋白的纯化　在　（）ｎ１Ｉ　含Ａｍｐ　的ＬＩ３培养基中，待　

（。肋　．．．．．值增Ｋ至０．５，』Ｊｆｌ　ＩＰＴＧ至终浓度为　ｌ　ｒｅｔｏｏｌ／Ｉ　，３７　Ｕ　导培养　诱导４　ｈ后离心，菌体　

Ｊ｛ｊ　３０　ｍＩ　ＰＢＳ洗涤，ｌ０（）（）（）ｒ／ｒａｉｎ，离心ｌ０　ｍｉｎ，弃　上清；用ｌ　ｌ（）的ＰＢＳ审悬，超声破碎５　ｍｉｎ，运行　

５　ｓＩ＇ｑ隔５　，ｌ　２　０００　ｒ／ｒａｉｎ，离心ｉ０　ｍｌｎ收集包涵　

体，用３０　ｍＩ　含８　ｍｏｌ尿素的裂解缓冲液重新悬浮　

包涵体，然后趟声波碎３０　ｒａｉｎ，１４　０００　ｒ／ｍｉｎ离心　

１　５　ｒａｉｎ，取ｌ　清，加入３　ｍＩ　ＮＴＡ树脂材料，在冰浴　

搅拌的条件。Ｆ与目的蛋白结合。具体步骤按照　Ｔ１１ｅ　ＱＩ　Ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ　蛋白纯化试剂盒说明书　

进行。纯化后取收集产物进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳。　取少量纯化蛋白ｌ：１ＯＯ倍稀释，用分光光度　

计检测蛋白浓度后．其余部分冻存于一７０℃。　

１．２．４　重组蛋白多克隆抗体的制备　将冻于…７０　Ｃ融合蛋白用ＰＢＳ透析复性除去　

尿素，再，１ｊ　ＰＥＧ８０００浓缩，用分光光度计测定蛋白　浓度，取其中０．５　ｍＩ　（约含日的蛋白３００　ｆｉｇ），加入　

等体积弗氏完全佐齐Ｉｊ（Ｓｉｇｍａ公剐）允分乳化免疫　

１　５口龄Ｓ【　Ｆ鸡。存白　免后第ｌ４灭干Ｉｌ第２８灭分别　进行第二、三次加强免疫。首免后，每隔７　ｄ采一次　

，后两ｉ＿欠免疫佐制使用弗氏不完全佐剂，免疫剂　

最同首免。第　次免疫ｉ０　ｄ后采血，心脏采血分　离血清。　

Ｉ．２．５　多克隆抗血清的Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ及ＥＩ　ＩＳ八　分析鉴定　

参照《分子克降实验指南》　，运Ｊ＋｛半Ｔ转印法　

将表达的重组蛋白转印　ＮＣ膜｝　，将用该蛋白制　备的多丸降抗血清２００倍稀释作为　抗，作用　

１．５　１１，洗膜　，与５　０００倍稀释的辣根过氧化物酶　标　的羊抗鸡ＩｇＧ　ｆ１－ｉ用１．５　ｈ，洗３次后，ＤＡＢ显　

色，观察结　。

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