定量PCR技术研究进展

定量ＰＣＲ是在ＰＣＲ定性技术基础上发展起来的核酸定

量技术。自１９８５年Ｓａｉｋｉ等首次描述聚合酶链反应（Ｐｏｌｙ－

ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术以来，因其展现了前所未有

的敏感性和特异性，受到了人们的高度重视。如今各种各样

以ＰＣＲ为基础的ＤＮＡ序列的扩增和控制方法得到了迅猛

发展，几乎已应用于基础研究的各个领域。但在许多情况下，

研究者们已不再满足于得知某一特异ＤＮＡ序列的存在与

否，他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。因而，借助ＰＣＲ

对基因快速、敏感、特异而准确的定量成为目前分子生物学

技术研究的热点之一。１定量ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ）的原理

１９８９年，Ｗａｎｇ等首先报道了定量技术用于ｍＲＮＡ的定

量检测。因为ＰＣＲ反应每个循环的产物均为下一个循环的底

物，并按指数级扩增，所以可以用方程Ｓ＝Ｓ０（１＋Ｅ）ｎ来推算扩

增产物，Ｓ０是初始模板核苷酸量，Ｅ是扩增效率，ｎ是循环次

数。但是Ｅ只能在有限的循环周期中保持相对恒定，通常是２０￣３０个循环，随后扩增效应减慢直至０，扩增过程到达平台

期，此时，ＰＣＲ产物的积累不再依赖于初始模板核苷酸量。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等在研究ＰＣＲ扩增平台期时发现，由于目的基因及

引物初始浓度的差异，ＰＣＲ的平台期可在１５￣２５个循环时出

现。因而，达到平台期的ＰＣＲ循环次数是不能预测的，必须用

实验来确定平台期出现的循环数。在ＰＣＲ扩增的指数增长过

程终止前的循环数的多少取决于扩增效率Ｅ和起始样本的特

异核苷酸序列丰度。对于一个给定的扩增片段，起始样本的含

量越大，则指数扩增过程越短。Ｅ取决于诸多因素，如引物和

扩增序列的特性、组分的浓度及反应温度等。即使同时使用同

样的试剂及操作、同等反应条件，ＰＣＲ法管与管间的扩增效率

也可能有明显差别，这是因为影响产物量的任何一个因素的

微小变化都会显著地改变产物的量。这些因素包括所用仪器，

反应条件（如多聚酶、温度、底物浓度、Ｍｇ２＋浓度、循环次数、抑

制物的存在、标本处理及模板降解等）。２定量ＰＣＲ技术的方法

２．１ＰＣＲ产物的直接定量

因为不同样品的ＰＣＲ产量是可以测定的，由此可推算

出每份样品在ＰＣＲ扩增开始时的靶ＤＮＡ的相对量。与设定

的外源性标准作对照，如先对未知量的靶ＤＮＡ作系列稀释，

两者比较，即可对未知量的靶ＤＮＡ绝对定量。但是，由于上述扩增效率差异，对样品间ＰＣＲ产量作比较会产生很不准

确的结果。而且，对ＰＣＲ产物的定量必须在指数扩增期进

行，因为在平台期扩增产物的累积量并不受初始模板量的影

响。必须对单一反应的多个不同时间点的产物量作直线回归

分析才能获得可靠的统计学结果。由于此法简单，故被许多

学者用作粗糙的定量分析。２．２有限稀释法

有限稀释法起初是用于细胞生物学的定量方法。对检测

样本进行梯度稀释后做ＰＣＲ，直至检测结果为阴性为止。这

样即可以依据ＰＣＲ检测阳性结果的最大稀释度结合外参照

进行定量。扩增产物的检测多采用凝胶电泳。为了增加这种

定量方法的可重复性，应使ＰＣＲ过程最佳化，一个或几个靶

分子能被稳定检测出。在每个稀释度均应进行多次反应，结

果利用统计学泊松分布原理来计算。必须严格消除污染物，

以免假阳性干扰正常结果。这种方法的优点是定量不依赖扩

增效率，但需要对每份样品的各个稀释点做多次ＰＣＲ反应，

工作繁琐，系统误差大，现在已经很少有人使用。２．３外对照ＰＣＲ定量

外对照法是最简单的ＰＣＲ定量方法。外对照通常是质

粒，一个已知量的标准稀释系列，与待测样品中的靶序列用

相同的引物在两管中分别扩增，由这个标准稀释系列ＰＣＲ

产物／起始物量获得标准曲线，即可推测出在同一ＰＣＲ扩增

循环中的样品靶序列的起始量。但这个定量过程必须在指数

扩增期进行。这种方法甚至可以消除管与管之间的差异，但

不能消除样本与样本之间的差异。

外对照ＰＣＲ定量可与巢式ＰＣＲ联合使用。虽然在巢式ＰＣＲ反应中，内外两对引物也将产生一些不同种类的非特异

性产物，但其量常不能达到干扰定量的水平。一些相对简单

的非特异性检测方法可用于对巢式ＰＣＲ产物进行定量。

使用外对照ＰＣＲ定量时，ＰＣＲ对试验过程中微小差异

的敏感性将会对扩增效率产生影响，有可能破坏实验的准确

性和可重复性。因此，建立外对照定量ＰＣＲ，必须分析这个试

验的准确性和可重复性的限制程度。２．４内对照ＰＣＲ定量

内对照ＰＣＲ，即在同样的反应条件下，在同一个ＰＣＲ管

中扩增来自同一ＤＮＡ的一段靶序列和一段内对照序列。通

过比较两种序列的扩增产量可对靶基因定量。只有当靶序列

与内对照序列的起始量和扩增效率非常相似时，才能精确的

对靶序列定量，这取决于选择不同引物最佳配比的经验。这

种扩增效率的差异常发生在ＰＣＲ的终末期，故应在指数扩作者简介：刘芳萍（１９７３～），女，汉族，博士，主要从事兽医

药理学与毒理学研究。定量ＰＣＲ技术研究进展

刘芳萍，曲鹏

（东北农业大学动物医学院药理教研室，哈尔滨１５００３０）１６畜牧兽医科技信息２００６．０９专论与综述

增期对产物进行分析。由此可见，循环次数和初始模板ＤＮＡ

的量对结果的影响很大。内对照ＰＣＲ可以消除管与管之间

的变异，并在一定程度上消除样本与样本之间的变异。Ｙｏｌｏｖ

等为了增加准确性，利用双重内对照定量ＰＣＲ，同时扩增ＨＩＶ病毒基因和宿主细胞特征基因ＨＡＬ－Ｄｑａ，二者比率作

为ＤＮＡ水平感染程度指标，用于监测病毒复制和药物疗效

评价。

实验中所加入ＤＮＡ的量对于一个成功的定量分析是非

常关键的，因为太多的模板ＤＮＡ会产生非特异性扩增产物。

另一个重要因素是要保证靶序列和内对照序列以相同的量

存在，才能对二者相对定量。内对照ＰＣＲ定量适用于检测单

基因缺失，如检测肌萎缩蛋白基因或Ｐ１６基因以鉴别等位基

因的缺失，以及发生染色体的大片段异常，如三体性或非整

倍性。２．５竞争性ＰＣＲ定量

从定量ＰＣＲ反应动力学分析中可以看出，最符合ＰＣＲ

数学模型、最精确、最易于操控、最有前途的定量ＰＣＲ技术

就是竞争性ＰＣＲ，它是Ｇｉｌｌａｎｄ等人于１９９０年首先发明的，

可用于ＤＮＡ和ＲＮＡ的定量。竞争性ＰＣＲ是向样本中加入

一个作为内标的竞争性模板，它与目的基因具有相同的引物

结合位点，在扩增中二者的扩增效率基本相同，而且扩增片

段在扩增后易于分离，然后根据内标的动力学曲线求得目的

基因的原始拷贝数。

它首先需要构建一种竞争模板（ＤＮＡ或ＲＮＡ），这种模板

与靶基因（ｃＤＮＡ或ｍＲＮＡ）略有不同，或是多一个小片段，或

是少一个小片段，或是小部分或大部分序列的改变。这种模板

定量稀释后与样本在同一管中用相同的引物同时进行ＰＣＲ

或ＲＴ－ＰＣＲ扩增，二者竞争引物、核苷酸和聚合酶。由于竞争

作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板扩增产量逐渐减

少，两种模板ＰＣＲ产物的比值与二者初始状态时核酸含量的

比值有关，当两种模板的拷贝数相等时，它们的扩增产物也基

本相当，这时初始反应体系中内标模板的量也就代表了被检

测模板的量。如果这个竞争性模板选择并构建恰当，在整个反

应过程中扩增效率与靶序列扩增效率一致，就不一定要把反

应限制在指数扩增期，靶序列可以在较大范围内获得定量并

能检测到其２倍的差别。因此，竞争性ＰＣＲ被广泛用于细胞ＤＮＡ、ＲＮＡ以及病毒、细菌核酸的定量检测。尽管如此，这种方

法仍存在诸多不足，如竞争性模板制备较难，需要经过反复测

试；实践中其与靶基因模板的扩增效率很难达到完全相同；定

量原理从根本上说仍是采用基于标准曲线的类推法，单个标

准品的点变异对定量结果影响较大等。

竞争性模板常通过修改靶序列的克隆来构建。如一个小

的限制性片段的插入、缺失或通过体外诱变导入一个新颖的

酶切位点。另外，包含同一引物结合位点的异组织竞争物也

可使用。如果以目的基因为基础，通过诱导产生一小段缺失

或插入作为竞争性模板，长度范围为１０％￣１５％差异，就不会

明显影响扩增效率，这种模板可通过重叠延伸技术快速有效构建一个适用于ＤＮＡ和ＲＮＡ竞争性模板的方法。另外，还

可以构建一种含有特异引物识别序列适用于多重的非同源

性的竞争性模板。这种类型的模板可以用于ＤＮＡ或ＲＮＡ的

测定，而且能显著提高定量的精确性。在多重竞争性模板中

包含一个或多个参照基因（ＧＡＰＤＨ，β－ａｃｔｉｎ，β－ｇｌｏｂｉｎ等），

因为这些参照基因在生理或病理条件下转录水平不发生任

何变化，可用于估计最终结果的相对数值。２．６荧光定量ＰＣＲ

荧光定量ＰＣＲ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ

ｒｅｃｔｉｏｎ，ＦＱ－ＰＣＲ）是美国ＰＥ公司１９９６年研制出来的一种新

的核酸定量技术，该技术是在常规ＰＣＲ基础上加入荧光标

记探针来实现其定量功能的，通过供、受体发色团之间偶极－偶极相互作用，能量从供体发色团转移到受体发色团，受

体荧光染料发射出的荧光讯号强度与ＤＮＡ产量成正比，检

测ＰＣＲ过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。

荧光定量ＰＣＲ的原理是利用Ｔａｑ酶的５′→３′外切酶

活性，在ＰＣＲ反应体系中加入一个荧光标记探针。该探针可

与引物包含序列内的ＤＮＡ模板发生特异性杂交，探针的５′端标以荧光报告基团ＦＡＭ（６－羧基荧光素，荧光发射峰

值在５１８ｎｍ处），靠近３′端以荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ（６－羧

基四甲基若丹明，荧光发射峰值在５８２ｎｍ处），二者之间构成

能量传递，探针的３′末端被磷酸化以防止探针在ＰＣＲ扩增

过程中被延伸。当探针的结构保持完整时，５′－ＦＡＭ所发出

的荧光被３′－ＴＡＭＲＡ所吸收或抑制，不出现荧光信号的变

化。随着ＰＣＲ反应的进行，由于Ｔａｑ酶具有５′→３′外切

酶活性，当合成的新链移动到探针结合位置时，Ｔａｑ酶将探针

切断，探针的完整性遭到破坏，能量传递结构亦被破坏，３′

－ＴＡＭＲＡ的淬灭作用被解除，５′－ＦＡＭ的荧光报告基团的

荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，

同时一个荧光报告基团被释放出来。产物与荧光信号产生一

对一的对应关系，随着产物的增加，荧光信号亦随之增强。在ＰＣＲ反应过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变

化，当信号增强到某一阈值，此时的循环次数即循环阈值Ｃ１

被记录下来。Ｃ１和ＰＣＲ体系中起始模板数的对数之间有严

格的线性关系，利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的Ｃ１值和该阳性定量标准模板数经过对数拟和作图，制成标

准曲线，根据待测样品的Ｃ１值就可以准确的确定起始模板

的数量。

目前国内外常用的荧光定量ＰＣＲ技术有Ｔａｑｍａｎ技术、Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ技术、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ技术、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ技术、复

合探针法和ＳＹＢＲ荧光染料法。

荧光定量ＰＣＲ与常规ＰＣＲ相比，具有许多优点。⑴荧光

探针的使用，可以通过光电传导系统直接探测ＰＣＲ扩增过

程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有ＤＮＡ杂

交的高特异性和光谱技术的高精确性，进一步提高目的基因

检测的特异性。⑵光谱技术与计算机技术的联合应用提高了

灵敏度，有效地减少了劳动量。ＴａｑｍａｎＰＣＲ使用氩激光来激１７畜牧兽医科技信息２００６．０９专论与综述