FQ-PCR技术的原理及应用

简述PCR技术的主要原理及应用1. PCR技术的主要原理聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，其主要通过在一系列循环中扩增特定DNA片段，最终获得大量目标DNA的倍增产物。

PCR技术广泛应用于基因测序、基因克隆、突变分析、分子诊断等领域。

PCR技术的主要原理包括以下三个步骤：1.1 反应体系的准备PCR反应体系主要由以下组分组成： - DNA模板：即待扩增的目标DNA段，可以是从任何来源提取的DNA片段。

- 引物：由两个单链DNA片段构成，分别与目标DNA序列的两个相邻区域互补，作为DNA复制的起始点。

- DNA聚合酶：用于引导DNA的复制，具有高温稳定性。

- 反应缓冲液：提供适宜的酶活性和其他反应条件。

1.2 热循环反应PCR反应通过一系列的循环反应，完成DNA的扩增。

每个循环包括以下三个步骤：1.热变性（Denaturation）：将PCR反应管中的DNA双链变性为单链，提供引物结合的机会。

2.引物结合（Annealing）：反应体系通过降温，使引物与目标DNA互补的区域结合。

3.DNA扩增（Extension）：通过DNA聚合酶在适宜温度下复制DNA模板。

1.3 扩增产物的倍增反复进行热循环反应会连续复制目标DNA段，导致DNA的指数级扩增。

经过多个循环之后，扩增产物的数量将呈指数式增长。

2. PCR技术的应用PCR技术在生物学研究和医学诊断中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：2.1 基因测序PCR技术在基因测序中起到关键作用。

通过扩增需要测序的DNA片段，可以获得足够的模板量，用于测序仪的读取。

2.2 基因克隆PCR技术可用于基因克隆，通过引物的设计，扩增目标DNA片段后，将其插入到表达载体中，实现目标基因的表达。

2.3 突变分析PCR技术可以用于突变分析，通过引物的设计，扩增包含突变位点的DNA片段，然后通过测序或其他分析方法确定突变的存在与否。

2.4 分子诊断PCR技术在分子诊断中广泛应用。

调研报告全自动医用PCR分析系统【概述】自从1983年Mullis发明聚合酶链式反应（PCR）以来，PCR技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。

但是传统PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。

实时荧光定量PCR（FQ-PCR）是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。

它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累定时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和准确性等特点。

全自动医用PCR分析系统，就是以实时荧光定量PCR为基本技术、在计算机的辅助下而发展起来的高度自动化的PCR 分析系统。

【基本原理】实时荧光定量PCR的基本原理是荧光共振能量转移原理（FRET）。

当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。

在探针5’端标记一个报告基团（R），在3’端标记一个淬灭基团（Q），两者距离很近时（7~10nm），报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收，并依赖其较高的信噪比和良好的辨别能力进行定量检测。

实时荧光定量PCR的几个重要参数分别为：①荧光域值（threshold）：以PCR 反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3 - 15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。

②Ct 值：也称循环阈值，C 代表Cycle，t代表threshold。

Ct 值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR 反应循环数。

在PCR 循环过程中，即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻，可见Ct 值取决于阈值。

PCR的基本原理及临床应用PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是一种能够在体外快速产生大量特定DNA片段的技术。

它在遗传学研究、医学诊断、犯罪指认等领域起到了重要的作用。

本文将探讨PCR的基本原理以及其在临床应用中的意义。

PCR的基本原理是通过采用酶的体外扩增技术，使得DNA的某一特定片段在体外得到迅速、精确的扩增。

PCR主要涉及三个步骤：变性、引物结合和扩增。

首先，将待扩增的DNA加热到94-96°C，使其变性为单链的DNA。

接着，通过降温至50-65°C，引物与目标DNA片段特异性结合。

最后，在72°C下，加入聚合酶，使DNA链得以延伸合成。

PCR作为一种灵敏度高、特异性强的技术，广泛应用于临床诊断领域。

临床应用中，PCR能够对各种疾病进行快速、准确的检测，因此在疾病预防、治疗和监测中发挥着关键作用。

下面将分别探讨PCR在各个领域的应用。

在遗传学研究中，PCR被广泛应用于基因定位、基因组测序以及DNA指纹等方面。

通过PCR技术，可以快速扩增出基因特定区域的DNA片段，进而进行基因型鉴定和突变检测。

此外，PCR还可用于研究人类种群遗传变异、基因表达差异以及基因修饰等方面，为遗传学研究提供了有力的手段。

在医学诊断中，PCR的应用范围更加广泛。

例如，PCR可用于检测感染疾病的病原微生物，如病毒、细菌、霉菌等。

通过扩增病原微生物的特定基因片段，可以迅速、准确地确定感染的种类和病原量，从而指导临床治疗方案的选择。

另外，PCR还可用于早期癌症的检测，通过分析癌细胞所特有的突变基因的存在与否，提高早期癌症的检出率，对癌症的早期治疗起到重要的作用。

此外，PCR在犯罪学领域也发挥着重要的作用。

通过扩增被检物体内特定的DNA片段，可以进行DNA指纹比对，用以法医学上的犯罪指认和疑案侦破。

PCR技术具有高度特异性和敏感性，即便是仅有微量的DNA样本，也能通过PCR技术得到足够的扩增产物，用以鉴定人员的身份，确保司法公正。

荧光定量PCR的原理及使用荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。

其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。

2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。

3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。

下面介绍常用的几种检测方法：1、双链DNA内插染料某些染料如SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。

在PCR过程中SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。

SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。

当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。

因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。

SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。

2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。

3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。

4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。

要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。

在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。

2、TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。

由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

荧光定量PCR技术简介P ost By：2009-4-20 9:19:00荧光定量PCR技术简介荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通P CR相比，FQ-PCR具有许多优点。

本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简要叙述。

1 特点FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR 扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。

如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。

而FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。

实验一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪。

该仪器具有以下特点：①应用广泛：可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达研究、病原体检测及PCR条件的优化等。

②独特的定量原理：采用荧光标记探针，经激光激发后荧光量随PCR循环而累积，从而达到定量目的。

③工作效率高：内置9600型PCR扩增仪，电脑控制1～2小时全自动同步完成96个样品的扩增及定量。

④无须凝胶电泳：无须对样品进行稀释和电泳，只须通过特殊探头在反应管内直接检测。

⑤无管道内污染：采用独特全封闭反应管及光电传导系统，无须顾及污染。

⑥结果重现性好：定量动态范围高达五个数量级。

所以自从此项技术研制成功以来，受到许多科研工作者的重视并在多个领域得到应用。

2 原理和方法FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。

PCR技术的原理与应用PCR（聚合酶链反应）是一种分子生物学技术，其原理是通过反复循环的DNA扩增过程将特定的DNA序列扩增至大量，从而能够在短时间内快速复制出特定的DNA片段。

PCR技术具有高度敏感性、高选择性和高效性的特点，被广泛应用于基因工程、医学诊断、犯罪学鉴定等领域。

第一步是变性，在高温下（通常为94-98°C），将加热的DNA双链分离成两条模板链，形成单链DNA。

第二步是退火，降低温度使引物（特异性序列）与单链DNA的末端结合。

引物主要由两条DNA寡核苷酸组成，其中一条与待扩增的DNA序列的正向链完全互补，另一条与反向链完全互补。

引物结合后，会在DNA链上形成一个引物-模板复合物，这个过程通常需要较低的温度（通常为50-60°C）。

第三步是延伸，提高温度(通常为72°C)，引物上的酶（聚合酶）会在复合物上开始从引物的3'端启动DNA合成。

聚合酶在复制过程中加入新的核苷酸，使DNA链延长。

这个过程一直持续到达到DNA链的末端，形成两个完全互补的DNA片段。

然后，变性、退火和延伸这三个步骤会循环进行多次，使扩增产物呈指数级增加，从而扩增出特定的DNA片段。

1.基因工程和分子生物学研究：PCR技术可以用于合成DNA序列，构建重组DNA、基因组测序等。

通过与其他技术的结合，如限制性内切酶切割、DNA连接、酶切酶浸出等，可以构建表达载体、突变体、基因敲除等，进一步研究基因功能和调控机制。

2.临床诊断：PCR技术可以用于检测和鉴定病原体的DNA，例如病毒、细菌和寄生虫等。

通过扩增目标DNA序列，可以快速、灵敏地检测感染性疾病，如HIV感染、结核病、肺炎等。

此外，PCR技术还可以用于肿瘤标记基因的检测、身份鉴定等医学领域。

3.古生物学研究：PCR技术可用于从古代DNA中扩增目标DNA序列，从而恢复古代生物的遗传信息。

通过对古代DNA的研究，可以获得有关过去物种和群体结构演化的重要信息。