活性氧测定各种方法及原理

评述与进展 活性氧测定的基本原理与方法

林金明3　屈　锋　单孝全

(中国科学院生态环境研究中心,北京100085)

摘　要　综述了过氧化氢(H2O2)、一重态氧(1O2)、超氧阴离子自由基(・O-2)以及羟自由基(・OH)等活性氧的测

定方法。侧重介绍活性氧的化学反应法、捕捉法和直接测定法的基本原理和最新的进展情况,并比较了这几

种方法的各自特点。

关键词　活性氧,化学发光,自由基,评述

　2001211208收稿;2002205205接受本文系中国科学院“百人计划”和国家杰出青年科学基金资助项目(No.20125514)1　活性氧

氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体,人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中,就会感到

憋气的痛苦甚至死亡。所以,自从1770年代初英国人JosephPriestley发现氧以来,氧一直被人们认为是

一种对人体百益而无一害的气体。可是,科学技术迅速发展起来的今天,我们知道,不管是空气中的氧

还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性,与一般的金属铁一样,处于空气中的人体各部位都在不断地受

到氧的腐蚀而“生锈”,当然这种腐蚀与铁不同,它体现在人体的细胞水平上。特别是人体各种器官随着

年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。1969年McCord与Fridovich1发现,在生化反

应过程中O2获得一个电子还原生成超氧自由基(O-2),进而经过红血球的分离精制后获得O-2的清除

灭活酶,并命名为超氧化物歧化酶(superoxidedismultase,SOD)。这一发现激发了大批的科学研究者致

力于O-2的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究,去探索解明SOD在生理学上的意

义。同时由O-2衍生出来的过氧化氢(H2O2)、羟自由基(・OH)、激发态氧(一重态氧或称单线态氧,1O2)

也受到了人们的重视。近10多年来,活性氧在人体内的作用受到人们极大的关注,报道了大量有关活

性氧,特别是超氧自由基和羟自由基与机体细胞的许多功能活动以及各种疾病,如癌、动脉硬化、糖尿

病、心脑血栓、缺氧再灌注综合症、感染以及衰老效应等相关的研究论文和著作2～8,引起人们对活性氧

的普遍兴趣,从而激发了人们更深入地去研究活性氧的各种特性,开发各种相关的抗氧化、抗衰老物质,

在医学和分子生物学领域已成为一项广泛引起重视的研究课题。

所谓的活性氧,概括地说,是指机体内或者自然环境中由氧组成,含氧并且性质活泼的物质的总称:

主要有一种激发态的氧分子,即一重态氧分子或称单线态氧分子(1O2);3种含氧的自由基,即超氧阴离

子自由基(O-2)、羟自由基(・OH)和氢过氧自由基(HO2);2种过氧化物,即过氧化氢(H2O2)和过氧化脂质

(ROOH)以及一种含氮的氧化物(NO)等。这些物质化学反应活性强、存在寿命短,如1O2的平均寿命为2

μs、・OH自由基200μs、O-2自由基5s。正是由于它们寿命短、反应活性高,到目前为止除了H2O2以外,

其它活性氧的测定仍然是一项国际性难题,还没有特别专一有效的方法。一般情况下采用的分析方法

可大体有化学反应法9～36、捕捉法37～47和直接测定法48～59。本文按这样的3种分类针对不同活性氧的

测定方法作一概括性的总结,比较它们各自特点。

2　化学反应法

由于活性氧具有较高的反应活性,它们可以与许多不同的化合物发生化学反应,由此产生各种不同

的反应生成物,根据这些反应生成物或者反应物的变化程度可以进行定量或者定性分析。通常采用的

仪器分析方法有,化学发光法9～16、紫外2可见吸收分光光度法1,17～22、荧光光度法23～25、电子自旋探第30卷

2002年12月 分析化学(FENXIHUAXUE)　评述与进展

ChineseJournalofAnalyticalChemistry 第12期

1507～1514针26～29以及选择性电极法30～36等。化学反应法的特点是测定灵敏度高、廉价、操作简便等。但是,化学

反应法的特异性相对比较差,一些氧化还原反应或者酶催化反应往往对测定结果的判断产生影响,一般

需要其他分析方法作为比较,才能获得满意的结论。

2.1　化学发光法

化学发光测定法是仪器分析中灵敏度最高的方法之一,已在医学、环境以及工业分析等许多领域里

得到广泛的应用60～63。活性氧的化学发光研究也是活性氧测定法研究领域中比较活跃的分支之一,特

别是针对H2O2测定,有许多灵敏度高、选择性好的化学发光体系64～68。进年来,笔者在H2O2测定方面

开发了一系列高灵敏度的化学发光分析法69～72。除此之外,目前比较成功的活性氧化学发光测定法主

要有鲁米诺法(luminol)、光泽精法(lucigenin)和cypridinaluciferinanalog(CLA)法。

通常,鲁米诺在碱性溶液(pH10左右)中,首先形成单价阴离子,然后在催化剂,如酶,Fe2+、Co2+、

Ni2+和Cu2+等过渡金属离子或者金属络合物的催化下与溶液中的溶解氧或者过氧化氢发生氧化还原

反应,生成激发态的两价阴离子氨基肽酸盐(APD),APD经非辐射性跃迁回到基态时,放出光子73,74。

自从1928年Albrecht75报道了鲁米诺的化学发光现象以来,70多年过去的今天,鲁米诺的化学发光反

应机理仍然没有得到满意的解决。近年来,笔者在研究金属过氧化物的化学发光时发现,在不存在任何

催化剂的条件下,向BaO2或者MgO2固体粉末中注入鲁米诺溶液,仍然可以观察到很强的发光现象76,

这一发现已被应用于以鲁米诺衍生物ABEI作为标记物的化学发光柱后测定法77,78。利用固2液非均相

化学发光体系,在弱酸性或者非缓冲介质条件下,同样能够观察到鲁米诺与过氧化氢的发光现象71。

这些结果表明,鲁米诺发光与否取决于活性氧的生成条件,而与鲁米诺溶液的酸碱度似乎没有直接的关

系,介质的酸碱度影响了激发态APD的发光强度和发光波长。所以,从理论上来说,鲁米诺化学发光法

可以应用于各种不同介质中的H2O2、・O-2、・OH、1O2测定,这就导致了测定选择性差的问题。因此,在许

多情况下,活性氧的鲁米诺化学发光法只能作为定量或者定性分析的辅助手段。

在发现鲁米诺化学发光后不久,Gleu和Petsch两人79于1935年发表了第一篇光泽精化学发光的论

文。在碱性条件下,光泽精与H2O2,O-2等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2methylacridan)。相比

之下,光泽精对于活性氧测定的选择性则相对比较高,有许多报道76,80,81光泽精只有在超氧活性自由基

存在下发生发光现象。但是,在实际应用中,H2O2的分解过程同样产生O-2自由基,难以定性地判断分

析结果。

还有一类特殊的化学发光试剂,化学名称为22methyl262phenyl23,72dihydroimidazo21,22apyrazin232

one,简称CLA,1970年代由日本化学家Goto等82合成。CLA的特点是不与生物机体内的H2O2或者・

OH发生反应,只与O-2或者1O2发生特异性的化学发光反应,发光波长为380nm83。这一现象已被应用

于白血球的功能性检查方面的研究84～86。Goto等87还开发了CLA的衍生物,MCLA、FCLA、Nakano和

Fujimori等88～90对这一类试剂的化学发光机理和反应的动力学作了详细的研究,报道了CLA,MCLA与

活性氧的化学反应机理。FCLA是目前化学发光试剂中发光波长(532nm)最长的试剂,发光效率比CLA

高出近10倍,由于这一特点,在进行生物样品中・O-2或者1O2测定时,能够有效地降低酶、・OH等干扰物

质的影响。

2.2　分光光度法

活性氧的分光光度测定,最常用的方法有细胞色素丙(cytochromeC)的超氧自由基还原法1,20和硝

基四氮唑篮(nitrobluetetrazolium,NBT)还原法92。具有氧化活性的细胞色素C被・O-2还原后,形成了在

波长550nm处有强吸收的亚铁细胞色素93,可以用于O-2的直接测定,在SOD存在下,O-2受到SOD的

催化形成H2O2和O2,以被开发为SOD的间接定量分析法94。

但是,活性氧的细胞色素丙还原法存在着其它还原性物质,如HADPA和还原性酶的干扰,一般情

况下无法直接用于O-2的定性分析,需要比较在SOD的存在下,是否还有O-2与细胞色素丙发生反应的

结果,从而判断O-2的生成与否。

同样,如图1所示,NBT在O-2的作用下,还原生成不溶于水、蓝色的二甲替(diformazan)92,95,它的8051 分析化学第30卷

图1　硝基四氮唑蓝与超氧阴离子自由基反应的颜色变化

Fig.1　Colorchangeofthereactionofnitrobluetetrazoliumwithsuperoxideanionicradicalion最大吸收波长560nm,吸光系数达10,000以上,测定

灵敏度相当高。笔者在进行KIO42H2O2化学发光反

应体系的机理过程中70,使用NBT反应测定O-2,获

得良好的结果。但是,由于二甲替不溶于水,长时间

放置会出现沉淀现象,难以应用于测定细胞或者水

溶液体系中O-2形成的时间推移变化。Sutherland和

Learmonth96报道了利用水溶性NBT衍生物测定O-2的方法,解决了生成物沉淀所导致的测定困难问题。

应用分光光度法测定活性氧的比较简单方法还

有H2O2的Ti∆检测法97,辣根过氧酶(HRP)法20,

过氧化物酶法21和乙醇脱氢催化酶法98等等。

2.3　荧光光度法

与化学发光一样,荧光分光光光度法也是灵敏

度高,操作简便的分析方法之一。利用荧光光度法

测定活性氧的报道不多,这里仅举几个例子,希望能

够起到抛砖引玉的作用。比较典型的例子是,二氯

荧光素(DCFH)在过氧化物酶存在下,被H2O2或者

HO-2氧化形成具有有萤光的DCF,可以有效地应用

于H2O2定量分析23。利用2,32二氨基萘(DAN)与

NO-2在酸性条件下发生反应,形成荧光性的12(H)2

萘三氮茂环,有人提出用2,32二氨基萘(DAN)作为

NO的测定方法24。最近,Kojima等25开发了可以应

用于生物机体或者细胞培养过程中NO测定用的二氨基荧光素222联乙酰(DAF222DA),检测灵敏度达5

nmolΠLNO。随着合成技术的不断提高,相信今后还会出现更灵敏、使用更为方便的活性氧测定用的荧

光试剂。

2.4　电子自旋共振法(ESR法)

ESR作为活性氧的化学反应后的检测方法,可以理解成是一种自由基的标识反应,即向活性氧生成

的反应体系中添加本身带有不对称电子的自由基,这一添加物与活性氧发生反应后失去不对称电子,从

而导致ESR信号的变化。Utsumi等27在研究生物机体或者生物膜的构造过程中,使用了硝基木酮自由

基作为反应的添加物,硝基木酮自由基在与O-2,OH或者生物微粒体(microsome)等的电子传输系统发

生反应过程中,被还原生成羟胺或者羟氨基,从而失去单自旋电子,在ESR测定中体现为信号的减弱。

另外,与TMP(2,2,6,62tetramethyl242piperidone)类似的哌啶衍生物,在1O2的作用下,可与硝基木酮自由基

发生氧化还原反应,也可应用于1O2的测定26。但是,这一方法同样存在测定选择性差的问题,除了1O2以外,其他种类的活性氧或者电子供给体同样可以向硝基木酮自由基提供电子,影响对ESR信号的判