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亚细胞核地分离和鉴定

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亚细胞核的分离和鉴定
关键词：细胞 试剂 试剂盒 甲苯胺蓝 试剂 标准物质 北京标准物质网
1、细胞核的分离 细胞核作为一个功能单位，完整地保存遗传物质，并指
导RNA合成，进而表达出相应的蛋白，在一定程度上细胞核控制着细胞的代谢、
生长、分化和繁殖活动。因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的
首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，可用分级离心等方法将细胞核进行分
离纯化。

细胞核的分离目前较常采用以蔗糖为介质的差速离心法，可分为细胞核分离
和纯化两大步骤。细胞匀浆后，先以0. 25mol／L。的蔗糖1000g离心洗涤，
然后在0. 34mol／L和0．88mol／L的蔗糖梯度中1500g离心15～20分钟，
沉淀即为纯化的细胞核。现在细胞核的提取试剂已商业化生产，公司试剂盒中会
提供详细的操作步骤。细胞核被分离后，可经甲苯胺蓝染色在光学显微镜下观察，
或直接在电子显微镜下观察核内染色质的分布情况。

2、细胞核的鉴定
(1)光镜直接观察：普通光学显微镜下，贴壁细胞的细胞核为位于细胞中央
的一团较深物质，悬浮细胞会显得更模糊，且都无法清晰分辨细胞核与细胞质。
常用于细胞核的化学染料包括甲紫、苏木精、醋酸洋红、甲基绿等。苏木精．伊
红染色简称HE染色，是组织学、胚胎学和病理学最常用最基本的细胞核细胞质
染色方法，细胞核嗜碱被苏木精染成蓝色(图5-3-1)。
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(2)电镜观察：电镜能清晰地观察到细胞核基质的基本形态，以及核膜、核
仁、核染色质等，所以可以被应用到细胞核的可视化研究中。比如细胞凋亡，电
镜下清晰可见，核基质由结构完整到出现紊乱，到凋亡小体的形成并由核内排出。
因此，电镜扫描可以清晰展示出细胞核的各个阶段的状态，能更形象化地应用于
细胞核功能学、发育学以及细胞凋亡等研究中(图5-3-2)。

(3)细胞学鉴定：核酸荧光染色后，可采用荧光显微镜、共聚焦激光扫描荧
光显微镜以及流式细胞仪检测。常用的三大经典核酸染料包括：插入性染料，如：
ethidium bromide(EB)和propidiumiodide(PI)；DNA小沟结台染料，如：
DAPI和Hoechst：以及其他类核酸染料，如：吖啶橙、7-AAD、LDS751等。
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DAPI是一种具有膜通透性的强力DNA荧光染料，可用于活细胞以及死细
胞的细胞核染色。荧光显微镜下，DAPI可被紫外光激发出蓝色荧光，其荧光激
发光358nm以及发射光461nm。因为彼此的发射光很少重叠，DAPI通常与绿
色荧光(如GFP)和红色荧光(如RFP)结合，三者被用于细胞的多重荧光染色(图
5-3-3)。Hoechst染料常用的有Hoechst 33258和Hoechst 33342，其激发
光和发射光与DAPI非常相似，都可用于活细胞和固定细胞的标记。DAPI和
Hoechst染料是科研人员最常使用的用于细胞核标记的荧光染料。

此外，在细胞增殖的研究中，人们常常将Brdu／Edu等底物掺入到增殖的
细胞核DNA链中，再通过荧光素标记Brdu/Edu，继而显色增殖细胞的细胞核。
在细胞凋亡研究中，人们常采用TUNEL染色标记凋亡细胞的细胞核。

由于三维重建等优点，共聚焦显微镜在细胞成像技术中的地位逐渐突出。：
DAPI虽然常用，但是多数共聚焦显微镜没有紫外线波段的激发光，所以其他一
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系列更适用于共聚焦的核酸荧光染料被开发出来，比如TOTO系列，TO-PRO
系列，SYTOX系列以及SYTO系列等。

3、方法优缺点比较与选择 细胞核检测较少采用细胞免疫荧光或原位免疫
组化的检测方法，而普遍采用荧光染料与核酸物质直接结合而显色。组织染色中，
细胞核的常规光镜观察优先选择苏木精染色，简单方便，普通光镜就能得到胞质
区别明显的组织切片图片，但分辨率差，常常仅限于低倍镜下观看，且细胞核轮
廓不清晰，染色特异性差。

在多重细胞荧光染色时，DAPI和Hoechst染色为核酸染色首选，活细胞以
及固定后的细胞上都可以得到特异性的细胞核成像，且轮廓清晰，染色高效快捷，
由紫外光激发，与其他常用激发波段的波长基本不重叠。但DAPI为半透膜染料，
组织核酸标记并不理想，并且其紫外激发波段也不适用于所有共聚焦显微镜。

TOTO和TO-PRO等系列的核酸荧光染料常常用于共聚焦显微镜细胞成像，
并且远红外激发波段的染料更常见。远红外波段可以和其他可见光荧光染料组
合，进行多重荧光细胞成像，缺点在于普通荧光显微镜无法观测到。

电镜观察细胞核多数用于细胞凋亡或者其他细胞功能学的可视化研究中，为
其提供进一步的图像证据。

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第十章 细胞核与染色体

第十章 细胞核与染色体


7倍 6倍 40倍 5倍
共8400倍
2 骨架-放射环结构模型scaffold radial loop structure model
• 》认为30nm的纤维折叠为一系列的环（loop），沿染色体 纵轴结合在染色体骨架chromsomal scaffold。 • 》由螺线管形成DNA复制环,每18个复制环呈放射状平面排 列, 结合在核基质上形成微带(miniband)。 • 染色体包装的不同组织水平：染色体包装的实际形式可能 是多种机制（模型）的融合。
1 核孔由至少50种不同的蛋白质（nucleoporin）构
成，称为核孔复合体（nuclear pore complex，
NPC）。 2 一般哺乳动物细胞平均有3000个核孔。
3 细胞核活动旺盛的细胞中核孔数目较多，反之较 少。
4 在电镜下观察，核孔是呈圆形或八角形，现在一 般认为其结构如fish-trap。
①亲核蛋白通过NLS识别受体importinα并结合形成转运复合物。不需能量， 依赖NLS. ②在importinB 的介导下，转运复合体与核孔复合体的胞质纤维结合 ③转运复合物通过改变构象的核孔复合体从从胞质面转移到核质面 ④转运复合物在核质面与Ran-GTP结合，并导致复合物解离，亲核蛋白释放。 ⑤受体的亚基与结合的Ran返回胞质，在胞质内Ran-GTP水解形成Ran-GDP并与 importinB解离， Ran-GDP返回核内再转换成Ran-GTP状态
抽提后核孔胞质面的结构 （Cytoplasmic face， cytoplasmic particles）
抽提后核孔核质面的结构 （Nuclear face basket inner complex）
（二）核孔复合体成分的研究
核孔复合体主要由核孔蛋白构成，可能含有30余种不同 的多肽，共1000多个蛋白质分子。 具有同源性，高度保守。 所有的核孔复合体蛋白统一命名为核孔蛋白。 其中gp210是第一个被鉴定出来的核孔蛋白，代表一类 结构性跨膜蛋白。
3.原生质体技术

3.原生质体技术

中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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2、 原生质体的分离
渗透压稳定剂
在配制酶液时，必须加入适量的渗透压稳定 剂，以代替细胞壁对原生质体所起的保护作用。 因为细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于低 渗透压的溶液中，就会立即破裂死亡。 甘露醇和山梨醇等糖醇是最常用的渗透压稳 定剂，有时也用葡萄糖。糖醇一般用于游离叶肉 等材料的原生质体。葡萄糖则常用于游离悬浮细 胞的原生质体。渗透压稳定剂的浓度因植物材料 不同而异，一般为0.3～0.7mol/L。
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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2、 原生质体的分离
试管苗的子叶、胚轴以及培养的悬 浮细胞具有无菌、不受生长季节影响等 特点。 许多试验结果指出，利用试管苗作 为供体材料时，苗龄对分离原生质体及 其后培养的效果影响较大。另外，培养 的悬浮细胞，如果经过多次的继代培养， 常常会出现再生植株能力减退和遗传上 的不稳定性等现象。
1.原生质体的研究概况
原生质体
核质体
植物细胞
胞质体
中南林业科技学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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1.原生质体的研究概况
1.2 原生质体的研究进展
1、1863年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast) 一词。 2、1892年，Klercker用刀片细切植物组织机械分离 出原生质体。 3、1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质 体获得成功。 4、1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质 体培养的再生植株。 5、1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水 稻原生质体培养再生植株。 6、1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养 再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。
第十章 细胞核与染色体(共62张PPT)

第十章 细胞核与染色体(共62张PPT)

— 哺乳类45S，果蝇38S
45S rRNA
32S rRNA 20S rRNA
28S rRNA 5.8S rRNA
18S rRNA
5S rRNA
rRNA的加工
核糖体亚单位的装配
核糖体组成：蛋白质+rRNA rRNA前体结合蛋白质—核糖核蛋白体颗粒； 核糖核蛋白体—大亚基和小亚基； 5SrRNA合成后转运至核仁参与核糖核蛋白体
致密纤维组分
核仁内电子密度最高的区域，位于浅染区的周围；
所含主要成分为正在转录的rRNA，此外还有一些RNA结
合蛋白； 颗粒组分
由直径15-20 nm的颗粒构成，是不同加工阶段的核糖
核蛋白体。
2 核仁的功能 rRNA前体的合成、加工 核糖体亚单位的装配
rRNA前体的合成及加工
rDNA的初级产物为rRNA前体
数量，位置、大小相对恒定，可作为鉴别特定染色 体的一个标志。
核仁组织区
位置：位于染色体的次缢痕部位； 含有编码核糖体的rRNA基因；
功能：在间期缔合核仁。
随体
位置：位于染色体末端的球形染色体节段
是鉴别染色体的一个重要标志 —— 通过次缢痕与染色体主体部分相连
端粒
是染色体末端富含Ｇ的重复序列； 作用：维持染色体的稳定性
Gp210位于孔膜区，功能包括：介导核孔复合体与核被膜连接；
—— X染色体失活
概念：构成真核生物染色体的基本结构蛋白， rRNA前体的合成及加工
核型（karyotype） ：染色体组在有丝分裂周期的表现，包括染色体的数目、大小和形态特征。
1号染色体中的DNA包装倍数
主动运输的选择性：
富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸。 组成：DNA、组蛋白、非组蛋白、少量RNA。
细胞生物学(第三版)复习课后题答案总结

细胞生物学(第三版)复习课后题答案总结

第一章大题（细胞基本知识）1、试论述当前细胞生物学研究最集中的领域。

答：当前细胞生物学研究主要集中在以下四个领域：⑴细胞信号转导；⑵细胞增殖调控；⑶细胞衰老、凋亡及其调控；⑷基因组与后基因组学研究。

人类亟待通过以上四个方面的研究，阐明当今主要威胁人类的四大疾病：癌症、心血管疾病、艾滋病和肝炎等传染病的发病机制，并采取有效措施达到治疗的目的。

2、细胞生物学的概念和研究内容答：概念：细胞生物学是以细胞为研究对象, 从细胞的整体水平、亚显微水平、分子水平等三个层次，以动态的观点, 研究细胞和细胞器的结构和功能、细胞的生活史和各种生命活动规律的学科。

细胞生物学是现代生命科学的前沿分支学科之一，主要是从细胞的不同结构层次来研究细胞的生命活动的基本规律。

从生命结构层次看，细胞生物学位于分子生物学与发育生物学之间，同它们相互衔接，互相渗透。

研究内容：细胞生物学的主要研究内容主要包括两个大方面：细胞结构与功能、细胞重要生命活动。

涵盖九个方面的内容：⑴细胞核、染色体以及基因表达的研究；⑵生物膜与细胞器的研究；⑶细胞骨架体系的研究；⑷细胞增殖及其调控；⑸细胞分化及其调控；⑹细胞的衰老与凋亡；⑺细胞的起源与进化；⑻细胞工程；⑼细胞信号转导。

3、细胞的基本共性答：所有的细胞都有相似的化学组成；脂-蛋白体系的生物膜；DNA-RNA的遗传装置；蛋白质合成的机器—核糖体；一分为二的分裂方式。

4、细胞生存所需的最基本的细胞结构和功能。

答：细胞的生存必须具备细胞膜、核糖体、一套完整的遗传信息物质和结构。

功能：①细胞膜为细胞生命活动提供了相对稳定的环境；为DNA、RNA、蛋白质的复制、转录翻译提供了结合位点，使代谢反映高效而有序的进行；又为代谢底物的输入与代谢产物的排除提供了选择性物质运输的通道，其中伴随能量的传递。

②细胞核是遗传信息储存和表达的重要场所和指挥部，细胞的分裂、生长、分化、增值等一切生命活动均受细胞核遗传信息的指导调控。