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利用RNA干扰技术沉默基因表达在本科实验教学中的设计与实践

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Hereditas (Beijing) 2019年7月, 41(7): 653―661

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收稿日期: 20190118; 修回日期: 20190512 基金项目: 南方科技大学教学教改项目(编号：ZLGC201603，JG201604，SJZLGC201701)资助[Supported by the Teaching Reform Projects of Southern University of Science and Technology (Nos. ZLGC201603, JG201604, SJZLGC201701)] 作者简介: 宋亚坤，硕士，实验员，研究方向：生物实验教学。E-mail: songyk@sustech.edu.cn 通讯作者:余春红，博士，工程师，研究方向：生物实验教学。E-mail: yuch@sustech.edu.cn DOI: 10.16288/j.yczz.18-343 网络出版时间: 2019/6/4 15:32:35 URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190604.1532.002.html

遗传学教学利用RNA干扰技术沉默基因表达在本科实验教学中的设计与实践

宋亚坤，张敏，王翘楚，彭玉荔，贾方兴，余春红 南方科技大学生物系，生命科学实验教学中心，深圳 518055 摘要: RNA干扰是由双链小RNA介导的基因沉默现象，已成为一个被广泛应用的反向遗传学研究技术。为了

让学生更好地理解该技术，本实验教学让学生自己选择靶基因，设计小干扰RNA 和引物，然后检测小干扰RNA介导的基因沉默效果。以2018年第五组为例，该组挑选了小鼠长链脂酰辅酶A合成酶1 (acyl-CoA synthetase long-chain family member 1, Acsl1)为靶基因，设计了两对特异性靶向Acsl1 mRNA的小干扰RNA，通过电穿孔的方式将其转染到3T3-L1中，然后提取细胞总RNA和合成cDNA，最后用相对定量PCR检测mRNA的表达量。结果显示两对小干扰RNA都有60%以上的沉默效果。近3年内，大约83%的学生都能独立完成所有实验并最终成功筛选到至少一对有效的小干扰RNA。该教学实践增强了学生对RNA干扰原理和实验的理解，锻炼了学生的实验与科研能力。 关键词: RNA干扰；小干扰RNA设计；实验课程；本科生教育

Laboratory design and practice for undergraduates: Using RNAi to modulate gene expression

Yakun Song, Min Zhang, Qiaochu Wang, Yuli Peng, Fangxing Jia, Chunhong Yu Life Science Experimential Teaching Center, Department of Biology, Southern University of Science and Technology, Shenzhen 518055, China

Abstract: RNA interference is a gene silencing phenomenon mediated by short double-stranded RNAs, which

has become a widely used research technology for reverse genetics. In order to make students understand the technology better, the students were required to select target genes, to design small interfering RNAs (siRNAs) and primers, and then to test the effect of gene silencing mediated by siRNAs. Taking the fifth group in 2018 as an example, Mus musculus acyl-CoA synthetase long-chain family member 1 (Acsl1) was selected as the target gene, two pairs of siRNAs targeting Acsl1 mRNA were designed and transfected into 3T3-L1 by electroporation, then the total 654 Hereditas (Beijing) 2019 第41卷 RNAs were extracted and synthesized to cDNA, and the expression levels of mRNAs were finally tested by relative quantitative PCR. The results showed that both pairs of siRNAs had more than 60% silencing effects. In the past three years, about 83% of the students completed all the experiments successfully and screened out at least a pair of effective siRNA. This teaching practice for undergraduates enhances students' understanding of RNA interference principle and technology, and exercises students’ lab experience and scientific research ability. Keywords: RNA interference (RNAi); siRNA design; laboratory course; undergraduate education

经典的RNA干扰是由双链小RNA介导的靶基因表达下降的现象，早期在植物[1]、真菌[2]、线虫[3,4]

等生物中被发现，后来被证实是一种高度保守的机制，广泛存在于生物界[5~7]。2006年，RNAi机制的

发现者Andrew Fire和Craig Mello被授予诺贝尔生理及医学奖。RNA干扰技术已成为一个很好的反向遗传学研究工具，被广泛用于基因功能的研究[5~7]

和基因治疗方式的研发[8~10]。其原理是双链RNA (double strand RNA, dsRNA)在细胞质内被一种称为Dicer的酶特异识别并剪切成长度为20~23 bp的双链小分子干扰RNA (small interference RNA, siRNA)[11,12]；

然后siRNA被组装到RNA诱导沉默复合体(RNA- induced silencing complex, RISC)中。该复合体含有多种蛋白成分，如核糖核酸酶、解旋酶。RISC被激活后，siRNA双链被解链成正义链与反义链，反义siRNA链按照碱基互补的原则与靶标mRNA完全互补结合，引导RISC对mRNA进行切割。切割位点发生在与反义siRNA完全互补结合的mRNA区，距离反义siRNA 5末端10~12 bp处。mRNA被切割后降解，基因表达因此受到抑制[5~7]。

经历20年的发展，RNA干扰技术日渐成熟，从科研实验室走进了本科实验教学。常见的教学内容是学生将教师设计和准备好的小干扰RNA或表达载体转入细胞或机体中，检测靶基因(如荧光蛋白)的表达或观察机体的变化[13~17]。虽然教学效果良好，

但这样的设计让学生动手操作的实验主要是细胞转染和结果观察或检测。虽然教师会讲RNA干扰的原理，但学生对RNA干扰原理和过程的理解可能不深刻或不全面。为了让学生更好地理解该技术，本教学实践在现代生物技术实验课里，以敲低3T3-L1细胞中基因的表达为目的，让学生自己选择靶基因、

设计siRNA、分析siRNA结合靶基因mRNA的区域和验证siRNA介导的基因沉默效果。该项目将序列分析、siRNA的设计和验证等实验融合成一个小项目“利用RNA干扰技术沉默基因表达”，要求学生全程自己动手完成所有实验，强调对学生能力的培养和强化学生对RNA干扰机制和过程的理解。本文介绍了该课程的主要内容，以及本实验设计的目的和意义，为RNA干扰在分子遗传学实验课、现代分子生物学实验课或现代生物技术实验课等相关实验课程的教学提供参考。

1 课程内容设计 该课为现代生物技术实验课，自2014年开始教学，授课对象为三年级的本科生，是生物技术专业的必修课，生物科学和生物信息专业的选修课。整个实验课程的内容是一个小设计型实验项目“利用RNA干扰技术沉默基因的表达”。首先让学生选择感兴趣的靶基因，查找相关信息，并分析序列、结构等，让学生参与实验的设计。其次，由于RNA干扰的作用机制中介导基因沉默的是siRNA，化学合成的siRNA也用于基因功能的研究[18,19]和siRNA药

物的研发[8~10]，本课程就让学生设计siRNA，然后

由公司合成，待收到合成的siRNA后，将其转染进细胞，然后检测siRNA对靶基因表达的影响，从而增加学生对RNA干扰机制的理解。该课让学生全程自己操作完成所有实验，更好地锻炼学生的动手能力和分析能力。课程的主要内容包括靶基因的挑选和分析、siRNA和引物设计、引物扩增效率检测、细胞培养、转染、细胞总RNA的提取和检测、cDNA合成和基因表达检测等(图1)。

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RNA干扰的机制及应用研究

RNA干扰的机制及应用研究

RNA干扰的机制及应用研究RNA干扰是一种常见的基因沉默现象，它通过RNA介导的机制抑制了目标基因的表达。

RNA干扰技术已经被广泛应用于基因功能的研究、基因治疗、病毒防治等方面。

本文将从RNA干扰的发现、机制、应用以及未来的研究方向四个方面来分析RNA干扰技术。

一、RNA干扰的发现RNA干扰最早是在植物体系中发现的。

1990年代初，研究人员发现一个叫做PTGS（post-transcriptional gene silencing）的现象，即植物细胞在接受病毒侵袭后，能够对病毒RNA进行序列特异性的剪切、降解和沉默。

2001年，RNA干扰现象被发现并证实存在于小鼠细胞中，这标志着RNA干扰技术正式进入了哺乳动物体系中的应用研究。

二、RNA干扰的机制RNA干扰的机制可以分为siRNA途径和miRNA途径。

二者的共同点都是通过RNA结构具有“互补性”来实现对靶基因的靶向沉默。

siRNA途径：siRNA是一种由RNA多聚酶Dicer处理mRNA而产生的双链RNA分子，其长度一般在21~23个核苷酸左右。

siRNA可以和RISC（RNA-induced silencing complex，RNA诱导的沉默复合物）结合，形成基因诱导的沉默复合物（gene-induced silencing complex，GISC）。

GISC可以很好地识别特定靶基因，并使RNA逊式降解（RNAse H）或翻译停止。

miRNA途径：miRNA是一种在细胞发育和分化方面起重要作用的小RNA分子，长度一般在21~24个核苷酸左右，具有一定的保守性。

miRNA的合成过程比siRNA略微复杂，但机理类似于siRNA。

miRNA的生物学功能是干扰翻译或即时沉默，这主要是通过miRNA结合到3'UTR（未翻译区域）上来完成的。

三、RNA干扰的应用RNA干扰技术可以被广泛应用于基因功能的研究、基因治疗、病毒防治等方面。

基因功能的研究：RNA干扰技术已经被广泛应用于功能基因组学研究。

RNA干扰技术的原理与应用

RNA干扰技术的原理与应用

RNA干扰技术的原理与应用RNA干扰(RNA interference, 简称RNAi)技术是一种通过调控特定基因的表达来研究基因功能的方法。

RNAi技术起源于植物中的反义基因抑制现象，1998年由美国科学家Andrew Fire和Craig Mello首次发现，并因此获得了2024年诺贝尔生理学或医学奖。

它是一种通过通过特异性降解mRNA从而抑制特定基因表达的机制。

1. 基因功能研究：RNA干扰技术可以用于研究特定基因的功能。

通过设计合适的小干扰RNA(siRNA)或更长的小干扰RNA(shRNA)序列，可以实现对基因的特异沉默，观察其对细胞和生物体的影响，进而揭示基因功能和信号通路。

2.高通量筛选：RNA干扰技术可以用于高效筛选具有特定表型的基因。

利用RNA干扰技术，可以沉默数千上万个基因，然后通过高通量技术分析引起细胞或生物体表型变化的基因，从而鉴定与其中一种现象或疾病相关的基因。

3. 药物研发：通过RNA干扰技术，可以选择性地抑制特定基因的表达，从而研发治疗人类疾病的药物。

siRNA或shRNA可以被导入细胞或体内，从而针对特定的基因和信号通路进行干扰治疗。

4. 基因治疗：RNA干扰技术可以通过直接导入构建好的siRNA或shRNA序列来治疗一些遗传性病。

例如，通过选择性靶向病因基因的RNA干扰分子，可以抑制该基因的表达，从而缓解或治愈疾病。

5.农业应用：RNA干扰技术还可以用于改良农作物，如控制农作物的病虫害、提高耐盐性、延长保鲜期等。

通过特异性干扰目标基因，可以提高农作物的产量、抵抗性和农艺性状。

总结而言，RNA干扰技术是一种重要的基因调控技术，可以通过特异性降解mRNA的方式实现对基因表达的干扰。

其应用广泛，可以用于基础研究、药物研发和基因治疗等领域。

它为揭示细胞和生物体的基因调控网络，研究疾病的发生机制，以及开发新型治疗手段提供了有力工具。

RNAi技术和基因沉默的机制和应用

RNAi技术和基因沉默的机制和应用

RNAi技术和基因沉默的机制和应用RNA干扰技术（RNAi）是一种广泛适用于生物科学研究的技术。

它是通过引导小分子RNA介导的基因沉默来抑制基因表达。

RNAi技术最初在植物和昆虫中被发现，但现在已广泛用于哺乳动物和人类细胞和组织中的基因表达调控研究。

在本文中，我们将讨论RNAi技术和基因沉默的原理、机制和应用。

RNAi的基本原理RNAi技术利用RNA分子的寡核苷酸（siRNA）或小干扰RNA （shRNA）来干扰基因的表达。

siRNA是由RNA分子降解酶Dicer切割长双链RNA产生的。

shRNA则是由人工合成的RNA分子。

在细胞内，siRNA或shRNA与蛋白质复合物RISC结合并介导基因沉默。

RNAi可以通过两种方式干扰基因表达。

第一种方式是RNA干扰（post-transcriptional gene silencing，PTGS），其作用在转录后RNA分子级别，导致RNA分子的降解或翻译受阻。

第二种方式是基因组学RNAi（simultaneous silencing of multiple genes，SSMG），其作用在基因组水平，导致染色体的某一区域沉默，从而抑制基因的表达。

RNAi的分子机理RNAi的分子机理是一系列复杂的分子事件。

RNAi起始于RNA分子的降解过程。

在细胞内，RNA分子通过RNA聚合酶复制DNA成为mRNA，而mRNA分子则被转录成蛋白质。

RNAi的分子机理是通过RNA分子的降解来干扰基因的表达。

RNA分子的降解分为两个步骤：第一个是dsRNA（双链RNA）的特异酶Dicer的作用分解成siRNA。

第二步骤是siRNA与RISC（RNA诱导的沉默复合物）结合，选择性攻击与siRNA相同序列的mRNA分子，导致mRNA分子的降解或翻译受阻。

这个过程在细胞中形成一个自停反馈回路，使得RNAi可以快速响应和调节基因表达。

RNAi的应用RNAi技术已广泛应用于生物医学研究中的基因调控和治疗。

RNA干扰技术在植物基因工程中的应用

RNA干扰技术在植物基因工程中的应用

RNA干扰技术在植物基因工程中的应用RNA干扰技术（RNA interference，简称RNAi）是一种通过抑制基因表达的方法，在植物基因工程中具有广泛的应用。

这一技术利用双链RNA分子的结构和功能，能够选择性地沉默靶基因，从而实现对植物基因的精确调控。

本文将重点探讨RNA干扰技术在植物基因工程中的应用，并探讨其优势和潜在的挑战。

一、RNA干扰技术的基本原理RNA干扰技术的基本原理是利用双链RNA（dsRNA）的结构和功能，介导靶基因的沉默。

当外源的双链RNA（如siRNA或shRNA）引入植物细胞后，它们被核酸酶Dicer酶切割成长度约为21-25个核苷酸的小分子片段。

这些小片段将与靶基因的mRNA互补结合，通过RNA 诱导的基因静默（RNA induced gene silencing，简称RIGS）途径，导致靶基因的mRNA降解或翻译抑制，从而达到沉默靶基因的目的。

二、1. 基因功能研究通过RNA干扰技术，可以选择性地沉默靶基因，从而研究其功能和作用机制。

通过合成靶基因的siRNA或shRNA，并将其导入植物细胞，可以观察到由于基因静默引起的表型变化，从而揭示基因的生物学功能。

2. 产量提高RNA干扰技术可以用于提高植物的产量和质量。

例如，通过沉默与种子发育相关的基因，可以提高作物的籽粒产量；通过抑制抗性基因的表达，可以增加作物对病害的抗性，提高植物的产量。

3. 抗病虫害RNA干扰技术可以用于植物的抗病虫害育种。

通过静默与病害相关的基因，可以使植物表现出抗病虫的特性。

这种方法比传统的农药使用更环保，对农业生产也具有很大的潜在价值。

4. 脱毒育种RNA干扰技术可以用于植物的脱毒育种。

通过沉默与毒素合成相关的基因，可以降低植物体内毒素水平，使植物更加健康。

这对于一些受毒素污染严重的地区，具有很大的经济和社会效益。

三、RNA干扰技术的优势和挑战1. 优势RNA干扰技术具有高度的特异性和灵活性。