翻译：MtPAR MYB转录因子作为一个开关参与苜蓿原花色素的合成

猴樟CbMYB308转录因子基因克隆及生物信息学分析胡甜叶苏梅郝瑷滢王艺润韩浩章*张颖王晓李张丽华（宿迁学院，江苏宿迁223800）摘要为研究猴樟CbMYB308蛋白的序列结构和功能，该文克隆猴樟CbMYB308基因CDS序列，进行生物信息学分析。

结果表明，克隆得到的序列具有1个942bp完整的ORF框，编码313个氨基酸，与沉水樟中收录的RWR91885.1基因序列一致性达97.29%，系统进化树的结果表明，猴樟CbMYB308蛋白具有较高的保守性；猴樟CbMYB308蛋白生物信息学分析结果表明，CbMYB308蛋白具有PLN03091家族结构域，为R2R3-MYB型转录因子，CbMYB308蛋白化学分子式为C1496H2356N432O489S11，相对分子量34.57kDa，理论等电点6.12，结构不稳定，无序化特征明显，为脂溶性和亲水性蛋白，磷酸化氨基酸位点有53个，亚细胞定位预测为细胞核。

关键词猴樟；转录因子；基因克隆；生物信息学分析中图分类号S792.23文献标识码A文章编号1007-7731（2023）03-0014-04猴樟（Cinnamomun bodinieri Levl.）为樟科樟属常绿乔木，主要分布于我国南方地区，是我国重要的精油加工树种、绿化树种和林用树种。

我国关于猴樟的研究主要集中于精油资源、林用特性、组培技术和引种栽培等方面，近年来的研究表明，猴樟的生长速度和抗寒性优于香樟[1]，可以替代香樟在我国北方地区推广应用。

很早就进行了香樟新品种选育工作，相继选育出涌金、霞光、御黄等彩叶品种[2-4]，然而，关于猴樟彩叶新品种选育较少。

研究表明，花青素种类、组成及其代谢调控是植物叶片呈色的关键因素，而花青素代谢主要受转录因子MYB、bHLH、WD40及其复合物的调控[5]，其中MYB 类转录因子调控功能研究最受关注，本研究基于转录组数据筛选出调控植物花青素合成的转录因子，并分析其特性，以期为猴樟新品种选育提供基因资源。

浙江农林大学学报，2016，33（2）：201-208Journal of Zhejiang A＆F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.003南方型紫花苜蓿根系盐胁迫应答转录因子鉴定与分析马进，郑钢，裴翠明，张振亚（浙江农林大学风景园林与建筑学院，浙江临安311300）摘要：转录因子可以调节众多下游基因的表达，在植物抗逆境中起重要的调节作用。

为了解析转录因子在南方型紫花苜蓿适应盐胁迫环境的分子机制，以南方型紫花苜蓿Medicago sativa‘Millennium’为材料，以正常培养（WT_ck1）和氯化钠（盐）胁迫（WT_N1）条件下的2个样品根系进行转录组分析，鉴定紫花苜蓿根系盐胁迫应答转录因子基因。

同时，随机挑选4个转录因子差异表达基因进行实时荧光定量qRT-PCR（3次重复），验证转录组测序技术（RNA-Seq）结果的可靠性。

结果表明：紫花苜蓿根系在250mmol·L－1氯化钠胁迫下72h，共检测到31907个基因表达量发生了改变，表达量差异达到2倍以上的基因共2758个。

其中，隶属于38个转录因子家族199个转录因子在盐胁迫下差异表达，上调表达104个，下调表达95个。

在各转录因子家族中，盐胁迫应答基因数量最多的是MYB基因家族，其后分别是AP2-EREBP，bHLH，WRKY，NAC和GRAS基因家族，这暗示了紫花苜蓿根系对盐胁迫响应可能是多种转录因子家族共同参与的应答过程。

qRT-PCR分析表明：4个随机选择的基因在胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致。

此外，MsERF-2b，MsbHLH，MsbZIP，MsGRAS，MsNAC，MsMGT-3a和MsWRKY等转录因子被选为与盐胁迫应答相关的候选转录因子。

该研究结果为阐明植物对盐胁迫的应答机制提供了新的线索。

图3表3参36关键词：植物育种学；南方型紫花苜蓿；转录因子；根转录；盐胁迫中图分类号：S722.3文献标志码：A文章编号：2095-0756（2016）02-0201-08Identification and characterization of salt-responsive transcriptionfactors in roots of southern type alfalfaMA Jin,ZHENG Gang,PEI Cuiming,ZHANG Zhenya（School of Landscape Architecture,Zhejiang A&F University,Lin’an311300,Zhejiang,China）Abstract:Transcription factors（TFs）,which can regulate downstream gene expression,play an important role in plant stress responses.In order to investigate the molecular mechanism of salt tolerance,the TFs of southern type alfalfa,in this study with250mmol·L－1NaCl stress,Illumina RNA-sequencing was performed to evaluate the expression spectrum of transcription factors in roots of the southern alfalfa cultivar“Millennium”.Then to verify the expression of four randomly selected genes,Quantitative Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction（qRT-PCR）（three repeated）was used.Results showed31907differentially expressed genes,2758 of which showed a difference of over two fold.Among these genes,199transcription factors belonging to38TF families were up-regulated and95were down-regulated.Genes from the MYB family were observed most,fol-lowed by AP2-EREBP,bHLH,WRKY,NAC,and GRAS.The qRT-PCR assay of four randomly selected genes confirmed the results of RNA-Seq analysis.In addition,candidate genes such as MsERF-2b，MsbHLH,Ms-bZIP,MsC2H2,MsGRAS,MsNAC,MsMGT-3a,and MsWRKY that may be involved in salt stress responses were identified.This study indicated that multiple TF families were involved in salt stress responses in the root of southern alfalfa types,and it provided new information for further study of the mechanism of a plant’s re-sponse to salt stress.［Ch,3fig.3tab.36ref.］收稿日期：2015-04-25；修回日期：2015-07-19基金项目：国家自然科学基金资助项目（31272494）；浙江省自然科学基金资助项目（LY16C170003）作者简介：马进，副教授，博士，从事植物逆境生理研究。

myb和myc转录因子
MYB和MYC转录因子是一类在植物中广泛存在的保守的转录因子。

MYB转录因子由三个不完全的重复组成，形成螺旋-转角-螺旋结构，每个重复中存在3个保守的色氨酸残基，有助于形成二级结构并提供一个有功能的MYB结构域。

而MYC转录因子含有两个相连的基本亚区，其中碱性氨基酸与DNA结合有关，螺旋-环-螺旋区参与二聚体的形成。

在植物中，MYB类转录因子可以分为三类。

第一类只含有一个MYB结构的MYB蛋白亚类，用于维持染色体结构和调节。

第二类含有两个MYB结构的R2R3亚类，参与次生代谢调节和细胞分化。

第三类含有三个MYB结构的RIR2R3亚类，参与细胞周期控制和分化。

不同的MYB蛋白与其靶基因的启动子中的不同顺式元件结合。

此外，MYC/MYB转录因子是一类依赖ABA调控系统中的转录因子，能够上调非生物胁迫下应答基因的表达。

例如，在拟南芥逆境胁迫下ABA诱导的基因中过表达35S:AtMYC2和35S:AtMYB2和35S:AtMYC2+AtMYB2，转基因植株表现出ABA过敏表型，其干旱胁迫耐受性也明显提高。

综上所述，MYB和MYC转录因子在植物中具有多种功能和作用机制，涉及染色质结构调节、次生代谢、细胞周期控制、ABA调控和非生物胁迫应答等多个方面。

黄花苜蓿MfMYB3R-3基因克隆及结构与功能的生物信息学
分析
柴华;杨曌;申忠宝;李莎莎;王晓龙;徐艳霞;吴玥
【期刊名称】《种子》
【年(卷),期】2024(43)5
【摘要】MYB转录因子是植物中分布最广的转录因子家族之一,在植物响应生物及非生物胁迫,调控逆境胁迫相关基因表达方面起着重要的作用。

本研究基于黄花苜
蓿转录组数据,鉴定和克隆了黄花苜蓿MfMYB3R-3基因,并进行了生物信息学分析。

结果表明,MfMYB3R-3基因CDS区长1701 bp,编码566个氨基酸,具有SANT保守结构域,为MYB3R型转录因子;MfMYB3R-3蛋白化学分子式为
C_(2690)H_(4314)N_(796)O_(873)S_(20),理论等电点为8.75,该蛋白是亲水性不
稳定偏碱性非分泌蛋白,不具有信号肽,无跨膜结构,亚细胞定位预测在细胞核。

系统进化分析发现,黄花苜蓿MfMYB3R-3蛋白与蒺藜苜蓿的MYB3R-3的亲缘关系最近。

【总页数】7页(P33-39)
【作者】柴华;杨曌;申忠宝;李莎莎;王晓龙;徐艳霞;吴玥
【作者单位】黑龙江省农业科学院博士后科研工作站;黑龙江省农业科学院畜牧兽
医分院;黑龙江省农业科学院草业研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q781
【相关文献】
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西北植物学报,２０１９,３９(６):０９６３－０９７３A c t aB o t ．B o r e a l ．ＧO c c i d e n t ．S i n．㊀㊀d o i :１０．７６０６/j ．i s s n ．１０００Ｇ４０２５．２０１９．０６．０９６３㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀h t t p ://x b z w x b ．a l l jo u r n a l ．n e t 收稿日期:２０１９Ｇ０３Ｇ１３;修改稿收到日期:２０１９Ｇ０４Ｇ２５基金项目:中国农业科学院科技创新工程(A S T I P ＧI A S １４);国家牧草产业技术体系(C A R S Ｇ３５Ｇ０４)作者简介:王菊萍(１９９２－),女,在读硕士研究生,主要从事牧草遗传育种研究.E Ｇm a i l :１４８４７１５５８５＠q q．c o m ∗通信作者:康俊梅,副研究员,主要从事牧草遗传育种的研究.E Ｇm a i l :K a n g ju n m e i ＠c a a s ．c n 蒺藜苜蓿M t b H L H １４８转录因子的克隆与转化及其功能分析王菊萍,王㊀珍,张铁军,龙瑞才,杨青川,康俊梅∗(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京１００１９３)摘㊀要:b H L H (B a s i ch e l i x Ｇl o o p Ｇh e l i x ,b H L H )转录因子家族是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物生长发育和盐胁迫应答机制.该研究利用同源克隆的方法克隆蒺藜苜蓿(M e d i c a go t r u n c a t u l a )的M t b H L H １４８基因,采用q R T ＧP C R 方法分析M t b H L H １４８基因在蒺藜苜蓿中的表达特性,构建超表达载体并通过农杆菌侵染法转化拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a ),对转基因拟南芥的耐盐性相关功能进行分析研究.结果显示:(１)从蒺藜苜蓿中获得M t b H L H １４８基因,该基因c D N A 全长１３４３b p ,包含开放阅读框为６０３b p,编码２０１个氨基酸,蛋白分子量２２．７k D ,等电点为１１．７６;蛋白结构分析显示,该蛋白无跨膜结构域,无信号肽,为亲水性蛋白;含有精氨酸/赖氨酸残基的保守结构域和典型的b H L H 结构域;二级结构以αＧ螺旋和无规则卷曲为主.(２)亚细胞定位表明,M t b H L H １４８蛋白定位在细胞核.(３)进化树分析表明,M t b H L H １４８与大豆(G l y c i n em a x )的亲缘性最近;启动子分析发现,该基因启动子区域含有光响应元件㊁MY B 结合位点以及A B A 应答元件A B R E ,可能参与非生物胁迫.(４)q R T ＧP C R 分析发现,M t b H L H １４８基因在蒺藜苜蓿的茎中表达量最高,叶中表达量最低,且M t b H L H １４８基因受A B A (１００μm o l /L )诱导并在盐胁迫(２００m m o l /L N a C l )处理８h 内表达量上调,而在低温(４ħ)处理时表达量明显下调.(５)成功构建超表达载体p C AM B I A ３３０１ＧM t b H L H １４８并转化拟南芥获得１６个抗性株系,经鉴定有１２个过表达株系,其中表达量最高的转基因株系为O E ８;对O E ８株系耐盐性功能分析发现,转基因拟南芥植株的发芽率明显高于野生型,盐胁迫下转基因拟南芥的根长是野生型的１．５倍,表明其耐盐性得到了增强.研究表明,M t b H L H １４８基因可能在盐胁迫调节机制中具有一定的调控作用.关键词:蒺藜苜蓿;转录因子;盐胁迫中图分类号:Q ７８５;Q ７８６文献标志码:AC l o n i n g a n dA n a l y s i s o f aB a s i cH e l i x Ｇl o o pＧh e l i x (b H L H )T r a n s c r i pt i o nF a c t o r M t b H L H １４８f r o m M e d i c a g o t r u n c a t u l a L ．WA N GJ u p i n g ,WA N GZ h e n ,Z H A N G T i e j u n ,L O N G R u i c a i ,Y A N G Q i n gc h u a n ,K A N GJ u n m e i ∗(I n s t i t u t e o fA n i m a l S c i e n c e s o fC h i n e s eA c a d e m y o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,B e i j i n g １００１９３,C h i n a )A b s t r a c t :T h e b H L Ht r a n s c r i p t i o n f a c t o r f a m i l y ,o n e o f t h e l a r g e s t t r a n s c r i pt i o n f a c t o r f a m i l i e s i n p l a n t s ,h a s b e e n r e p o r t e d t o i n v o l v e i n p l a n t g r o w t ha n ds a l t s t r e s s r e s p o n s e ．I n t h i s s t u d y ,h o m o l o g o u s c l o n i n gw a s u s e d t o a c q u i r e t h eM t b H L H １４８g e n e f r o mb a r r e l c l o v e r (M e d i c a g o t r u n c a t u l a )．q R T ＧP C Rw a s u s e d t o a n a l y z e t h ee x p r e s s i o n p a t t e r no f M t b H L H １４８g e n e i nb a r r e l c l o v e r ．T h eo v e r e x pr e s s i o nv e c t o rw a s c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f o r m e d i n t o A r a b i d o ps i s t h r o u g h a g r o b a c t e r i u mi n f e c t i o n ,s o a s t o a n a l y z e t h e r e l a t e df u n c t i o n so f s a l t t o l e r a n c e o ft r a n sg e n i c A r a b i d o p s i s．Th e r e s u l t s h o w s:(１)t h e f u l ll e n g t h o f M t b H L H１４８c D N A w a s１３４３b p,W hi c hc o n t a i n e d６０３b p o p e nr e a d i n g f r a m ea n de n c o d i n g２０１a m i n o a c i d s．T h e t h e o r e t i c a l p Io f M t b H L H１４８p r o t e i n w a s１１．７６a n dw h o e sm o l e c u l a rw e i g h tw a s２２．７k D．P r o t e i ns t r u c t u r e a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e p r o t e i nh a dn o t r a n s m e m b r a n e d o m a i n,n o s i g n a l p e p t i d e a n d i t w a s ah y d r o p h i l i c p r o t e i n．T h i s g e n ec o n t a i n e dh i g h l y c o n s e r v e db H L H d o m a i n s．A se x p e c t e d,t h es e cＧo n d a r y s t r u c t u r ew a s p r e d o m i n a t l yαＧh e l i xa n dr a n d o mc u r l．(２)S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o nr e s u l t ss h o w e d t h a t t h e p r o t e i n sw e r e l o c a t e i nt h en u c l e u s．(３)P h y l o g e n e t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a t M t b H L H１４８w a s c l o s e l y r e l a t e d t o G l y c i n em a x A n a l y s i so f t h e c i sＧr e g u l a t o r y e l e m e n t d e m o n s t r a t e d t h a t t h e p r o m o t e r so f M t b H L H１４８c o n t a i n e d l i g h t,h o r m o n e a n ds t r e s s r e s p o n s e e l e m e n t s,s u g g e s t i n g t h e i r i n v o l v e m e n t i n t h e b i o l o g i c a l p r o c e s s e s．(４)q R TＧP C Ra n a l y s i s o f t h e e x p r e s s i o n p a t t e r no f t h e M t b H L H１４８i nb a r r e l c l o v e r s h o w e d t h a t t h eh i g h e s t l e v e l i ns t e ma n d t h e l o w e s t l e v e l i n l e a f．F o r t r e a t m e n t,t h e g e n e sw e r e i n d u c e d b y A B A(１００μm o l/L),a n dw e r e r e p r e s s e d b y c o l d(４ħ)b u t u pＧr e g u l a t e d b y N a C l(２００m m o l/L)w i t h i n t h e f i r s t８h．(５)T h e p C AM B I A３３０１ＧM t b H L H１４８o v e r e x p r e s s i o n v e c t o rw a s s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f o r m e di n t o A r a b i d o p s i s．W eo b t a i n e d１６r e s i s t a n tl i n e sa n di d e n t i f i e d１２o v e rＧe x p r e s s e dl i n e s．A m o n g t h e s e o v e rＧe x p r e s s e d l i n e s,t h e t r a n s g e n i c l i n eO E８h a d t h eh i g h e s t e x p r e s s i o n l e v e l．A n a l y s i so f s a l tＧt o l e r a n c e f u n c t i o no fO E８s h o w e d t h a t a s i g n i f i c a n t l y h i g h e r g e r m i n a t i o n r a t ew a s o b s e r v e d i n s p i t e o f t h e i r i n d i s c e r n i b l e p h e n o t y p i c d i f f e r e n c e f r o m w i l d t y p e．S t a t i s t i c a l a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e r o o t l e n g t ho f t h e t r a n s g e n i c s e e d l i n g so v e rＧe x p r e s s i n g M t b H L H１４８w a sa b o u t１．５t i m e so f t h en o nＧt r a n s g e n i c p l a n t s, s u g g e s t i n g e n h a n c e d s a l t t o l e r a n c e．B a s e do n t h e s e r e s u l t s,w e i n f e r t h a t M t b H L H１４８m a yp l a y a r e g u l aＧt o r y r o l e i n p l a n t r e s p o n s e t o s a l i n i t y．K e y w o r d s:M e d i c a g o t r u n c a t u l a;t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s;s a l t t o l e r a n c e㊀㊀盐胁迫是一种常见的非生物胁迫,是造成苜蓿产量和品质下降的一个关键因素.通过遗传改良提升抗盐性是目前苜蓿耐盐性研究的有效方法.该方法既能避免资源浪费,又能增加苜蓿的产量,提高牧民的收入,有利于农业经济的可持续发展.转录因子(T F s)是一种结构蛋白,能够识别并结合基因启动子区域中的顺式作用元件,进一步调控下游基因的表达[１].在高等植物中,与盐胁迫相关的转录因子家族常见的有b Z I P㊁WR K Y㊁A P２/E R E B P和MY B四大类[２],b H L H转录因子家族在植物中仅次于MY B家族[３],但b H L H(B a s i ch e l i xＧl o o pＧh e l i x,碱性螺旋Ｇ环Ｇ螺旋)转录因子家族研究较少[４].M tＧb H L H１４８属于b H L H转录因子,b H L H转录因子含有２个保守区域[５]:一个是碱性区域,分布在多肽链的N端,含有大量碱性氨基酸,与D N A结合相关[６],另一个为H L H区域,分布在C端,由疏水氨基酸残基构成,利于b H L H之间相互作用形成二聚体[７].b H L H/H L H蛋白主要参与调控植物生长发育(如光信号传递[８]㊁植物激素信号[９Ｇ１０]㊁器官发育[１１]等)和逆境胁迫(干旱㊁低温㊁盐等[１２]).相关研究主要集中在拟南芥和水稻[１３],苜蓿中该基因的相关研究较少,而盐胁迫相关的研究更少[１４].研究表明,拟南芥器官发育相关的b H L H转录因子A I F２㊁A I F３和A I F４过表达的植株都表现出了明显的矮化现象,表现为圆形的㊁深绿色的叶片和短叶柄[１５].与拟南芥A I F s同源的番茄转录因子C u b H L H１,过表达番茄同样出现了矮化表型;外源乙烯或赤霉素(G A)处理后,改变了胡萝卜素在果皮中的含量,其可能与次级代谢产物相关,参与成熟柑橘类胡萝卜素的代谢[１６].此外,与次级代谢产物相关的花青素合成基因D F R在b H L H基因(Dc a３１７１６)表达缺失的情况下,抑制下游花青素合成通路相关基因的表达[１７].另外有研究表明, b H L H转录因子S P A T U L A[１８]和A L C与雌蕊发育相关[１９],AM S则与花粉粒发育相关[２０].干旱胁迫时,O s b H L H１４８通过参与茉莉酸信号途径对水稻的干旱耐受性起调节作用.用茉莉酸甲酯㊁脱落酸以及干旱㊁高盐㊁低温和机械损伤等非生物胁迫处理水稻时,O s b H L H１４８的转录水平迅速增加.进一步研究表明:O s b H L H１４８的过表达后会引起O s D R E B㊁O s J A Z等参与逆境应答和茉莉酸信号途径的相关基因上调[２１].研究发现CＧr e p e a t结合因子(C B F)调控通路在对冷应激反应中起着重要作用,在冷处理(４ħ)中,转N t b H L H１２３基因烟草的耐寒性显著增强,转基因植株的存活率和生物量显著提高[２２].近期研究中发现了一种耐盐的核内钙结合蛋白R S A１并确定了其相互作用的蛋白R I T F１(拟南芥b H L H转录因子A I F２).在拟南芥４６９西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷中过表达R I T F１能够增强转基因植株的耐盐性.同时R S A１和R I T F１调节了由盐胁迫产生的活性氧解毒作用相关基因的转录,调控了S O S１基因的表达,同时进一步实验证明,该基因对盐胁迫耐受性很重要[２３].蒺藜苜蓿是豆科模式植物,对其进行研究有助于深入研究紫花苜蓿及其他豆科牧草的耐盐特性.本研究克隆了蒺藜苜蓿M t b H L H１４８基因,分析了其在蒺藜苜蓿中的表达特性.构建了p C AMＧB I A３３０１ＧM t b H L H１４８超表达载体并转化拟南芥,通过对转基因拟南芥耐盐性相关功能的研究,以期为蒺藜苜蓿抗逆育种提供理论参考.１㊀材料和方法１．１㊀材料与处理蒺藜苜蓿野生型R１０８种子购于诺贝尔研究所,拟南芥野生型c o lＧ０本实验室保存.蒺藜苜蓿R１０８种子除硬实,春化３d后,置于人工气候室中培养(生长条件为１６h光照/８h黑暗,２５ħ光照/２２ħ黑暗).待萌发至根长约３c m后,移至１/２霍格兰营养液中水培(培养条件相同),取根㊁茎㊁叶和花提取R N A,反转录成c D N A,进行组织差异性表达分析,试验设３次重复.以上述同样的方法,选取生长３周且长势一致的蒺藜苜蓿幼苗进行胁迫处理,分别为２００m m o l/LN a C l㊁１００μm o l/LA B A和低温(４ħ),具体操作步骤如下:２００m m o l/L N a C l 胁迫处理后,分别在０㊁１㊁２㊁８㊁１２㊁１６和２４h取地上部分,立刻放入液氮中速冻,于－８０ħ保存备用.每个处理至少３个重复.同样的方法,１００μm o l/L A B A胁迫处理后,分别在０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１２和２４h取地上部分,立刻放入液氮中速冻,于－８０ħ保存备用.低温(４ħ)的取样方法和时间点与A B A胁迫处理相同,－８０ħ保存.１．２㊀实验方法１．２．１㊀蒺藜苜蓿总R N A的提取和c D N A的合成㊀参照T a K a R a总R N A提取试剂盒提取蒺藜苜蓿总R N A.以上述总R N A为模板,用T a K a R a反转录试剂盒反转录成c D N A,－２０ħ保存备用.１．２．２㊀M t b H L H１４８的克隆㊀以蒺藜苜蓿R１０８的c D N A为模板,利用P r i m e r５．０在线软件分别设计出上游引物１４８F和下游引物１４８R(表１),进行P C R扩增.将P C R产物在０．８％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离㊁切胶回收,将目的片段与p E A S YＧT５载体在２５ħ连接２０m i n,然后转化大肠杆菌感受态细胞(T r a n sＧT１),用枪头吸取１００μL菌液顺时针方向涂布于含有卡那霉素(５０m g/m L K a n a)的L B固体培养基上,３７ħ㊁倒置培养１２h后挑单克隆菌斑,然后３７ħ㊁２００r/m i n转速孵育５h,菌液P C R后选取阳性克隆送至北京天一辉远生物公司测序,选取测序结果正确的菌液保菌(４０％的甘油菌,－８０ħ保存)备用.１．２．３㊀M t b H L H１４８的生物信息学分析㊀利用D N AMA N在线软件对测序结果进行分析.利用E X P A S Y软件(h t t p s://w e b．e x p a s y．o r g/c g iＧb i n/ p r o t p a r a m/p r o t p a r a m)分析编码氨基酸的数目,蛋白相对分子量㊁等电点等理化性质.通过S O P MA表１㊀本研究所用的引物序列T a b l e１㊀P r i m e r s e q u e n c e su s e d i n t h i s s t u d y引物名称N a m e o f p r i m e r引物序列P r i m e r s e q u e n c e(５ᶄң３ᶄ)１４８F C T A T T C C A A C T C A A C C A C C T T C A C T１４８R C A G G C C C A A A A C C A A A A G T G T A T C T３３０１ＧF A G A A A A T C T T C G T C A A C A T G G T G G A３３０１ＧR T T C C T G A T T A T T G A C C C A C A C T T T G３３０１Ｇ１４８F G A A C A C G G G G G A C T C T T G A C A T G A C A T C A C C A T C T A C T A C A ３３０１Ｇ１４８R A A G G A G A A A A A C T A G A A A T T T A T C A A C C G G A A C T G A C G C C G １３０２Ｇ１４８F C T T G A C C A T G G T A G A T C T A T G A C A T C A C C A T C T A C T A C A A １３０２Ｇ１４８R A G T T C T T C T C C T T T A C T A G T A C C G G A A C T G A C G C C G G C G CA c t i nF G A A A T C A C A G C A C T T G C A C CA c t i nR A A G C C T T T G A T C T T G A G A G CM tＧA c t i nF A C A C T G T G C C A A T C T A T G A G G GM tＧA c t i nR T T G T C C A T C A G G A A G T T C A T A G T T T ５６９６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王菊萍,等:蒺藜苜蓿M t b H L H１４８转录因子的克隆与转化及其功能分析(h t t p s://n p s aＧp r a b i．i b c p．f r/c g iＧb i n/s e c p r e d_s o pＧm a．p l)在线分析软件预测蛋白质二级结构.用在线软件S i g n a l P４．０S e r v e r(h t t p://w w w．c b s．d t u．d k/s e r v i c e s/S i g n a l PＧ４．０/)预测信号肽.利用在线软件P S O R TI IP r e d i c t i o n对M t b H L H１４８蛋白进行了亚细胞定位预测.利用在线软件T MHMM S e r v e r(h t t p://w w w．c b s．d t u．d k/s e r v i c e s/T MＧHMMＧ２．０/T MHMM２．０．g u i d e．h t m l)对蛋白进行了跨膜结构预测.利用M E G A５．０构建系统进化树.用在线软件P l a n t C A R E(h t t p://b i o i n f o r m a tＧi c s．p s b．u g e n t．b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/h t m l/)对转录起始位置A T G上游长度为２K b启动子的序列进行分析.１．２．４㊀M t b H L H１４８在蒺藜苜蓿中的表达分析㊀以蒺藜苜蓿R１０８的根㊁茎㊁叶和花的R N A反转录的c D N A为模板,M tＧA c t i nF和M tＧA c t i nR为内参基因引物,参照T a K a R a公司的S Y B R T BG r e e n Ⅱ说明书进行操作,每个样品３次重复以减小误差.在７３００荧光定量P C R仪上进行定量分析,采用２－ΔΔC t法计算该基因的组织差异性表达水平;以上述同样方法,分析２００m m o l/L N a C l㊁１００μm o l/L A B A和低温(４ħ)胁迫处理下,M tＧb H L H１４８基因的表达量.１．２．５㊀超表达载体的构建及拟南芥的遗传转化㊀参照无缝克隆试剂盒,利用S n a p g e n e㊁P r i m e r５．０软件设计引物,目的基因两端含有１５~２５b p与线性化载体同源的碱基,引物分别为３３０１Ｇ１４８F和３３０１Ｇ１４８R.利用D N A快速内切酶N c oⅠ和B g lⅡ酶切p C A M B I A３３０１载体质粒,经连接酶５０ħ连接１５m i n,连接产物转化大肠杆菌后测序,含有正确序列的菌液保菌并提取质粒,命名为p C AM B I A３３０１ＧM t b H L H１４８.将该质粒转化农杆菌G V３１０１后,采取花絮侵染法,侵染拟南芥,并收获拟南芥T０代种子,置于含有草铵膦(４m g/LP P T)的１/２M S的培养基中筛选抗性苗.１．２．６㊀转基因拟南芥中M t b H L H１４８基因的鉴定及表达量分析㊀在含有草铵膦培养基中筛选幼苗,提取D N A,以１４８F和３３０１ＧR为引物进行P C R阳性鉴定,共获得１２株T１代转M t b H L H１４８基因拟南芥.以A c t i nF和A c t i nR为内参基因引物,鉴定不同转基因株M t b H L H１４８基因的表达量.１．２．７㊀转基因拟南芥耐盐性鉴定㊀将野生型拟南芥WT和T２代转基因拟南芥种子消毒后(H g C l２消毒１０m i n,d d H２O冲洗６~１０遍),置于１/２M S 固体培养基春化２d,然后移至人工气候培养箱培养,在０m m o l/L N a C l㊁１２５m m o l/L N a C l㊁１５０m m o l/LN a C l的１/２M S固体培养基上统计发芽率(每皿种１００粒,３次重复).同样的方法在１/２M S 固体培养基萌发种子,待根长至２~３c m时,选取长势一致的拟南芥幼苗移至含有浓度分别为０m m o l/ LN a C l㊁１００m m o l/LN a C l和１２５m m o l/LN a C l的１/２M S固体培养基上,培养２~３周,观察拟南芥的生长状况.１．２．８㊀G F P表达载体p C A M B I A１３０２ＧM t b H L H１４８的构建和亚细胞定位㊀以p C AM B I A３３０１ＧM tＧb H L H１４８质粒为模板,以１３０２Ｇ１４８F和１３０２Ｇ１４８R 为引物扩增目的基因.利用D N A快速内切酶B gＧl I I和S p e１酶切p C AM B I A１３０２载体质粒.P C R 产物和经过双酶切的p C AM B I A１３０２线性化载体切胶回收后,连接生成M t b H L H１４８ＧG F P融合表达载体,转化大肠杆菌㊁菌液P C R后送测序,选择序列正确的菌液保菌备用.首先制备拟南芥原生质体,然后将p C AMＧB I A１３０２ＧM t b H L H１４８融合表达载体和p C AMＧB I A１３０２空载体分别转入拟南芥原生质体中[２４],黑暗培养１８h后,在激光共聚焦显微镜检测G F P荧光信号[２５].２㊀结果与分析２．１㊀M t b H L H１４８的克隆与生物信息学分析利用同源克隆法获得蒺藜苜蓿M t b H L H１４８基因的C D S序列,全长１３４３b p,开放阅读框全长６０３b p.利用E X P A S Y软件分析表明M t b H L H１４８基因编码２０１个氨基酸,蛋白分子量为２２．７k D,等电点为１１．７６,蛋白的不稳定指数为４５．２９,脂肪系数为７７．６１,平均亲水指数为－０．６９０.蛋白二级结构以αＧ螺旋(５２．２４％)为主;其次是无规则卷曲(３９．３０％);延长链(４．９８％);β转角(３．４８％).利用S i g n a l P４．０软件对蛋白进行信号肽预测,分析表明该蛋白无信号肽(图１,A),利用P r o t s c a l e软件进一步分析蛋白的亲疏水性,该蛋白为亲水性蛋白(图１,B).T MHMM分析未预测到跨膜结构区(图１,C).P S O R TI IP r e d i c t i o n亚细胞定位分析表明其在细胞核分布概率为７８．３％;细胞骨架为８．７％;线粒体４．３％;细胞质为４．３％,分泌小泡为４．３％.表明M t b H L H１４８蛋白可能定位在细胞核.蛋白结构分析表明,该蛋白含有精氨酸/赖氨酸残基的保守区,且含有典型H L H区域(图２).６６９西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷A．信号肽预测;B ．蛋白的疏水性预测;C ．跨膜结构预测图１㊀生物信息学分析A．S i g n a l p e p t i d e p r e d i c t i o n ;B ．H y d r o p h o b i c i t ypr e d i c t i o n ;C ．T r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e p r e d i c t i o n F i g ．１㊀B i o i n f o r m a t i c s a n a l ys i s V v b H L H １４７．细菌(X P _００２２７９３０７．１);V v b H L H １４８．细菌(R VW ７１５９４．１);G m b H L H １４７．大豆(X P _００３５２９５１７．１);G m b H L H １４８．大豆(X P _００３５５０９１６．１);M t b H L H １４７．蒺藜苜蓿(X P _００３５９４７１８．１);M t b H L H １４８．蒺藜苜蓿(X P _００３６０９７９４．１);M t b H L H １４９．蒺藜苜蓿(X P _０１３４６９０７３．１);A t b H L H １４７．拟南芥(N P _５６６５６７．１);A t b H L H １４８．拟南芥(N P _５６６２８７．１);A t b H L H １４９．拟南芥(N P _５６３８３９．１);A t b H L H １５０．拟南芥(N P _５６６２６０．１);O s b H L H １４８．水稻(X P _０１５６２９２７７．１);O s b H L H １４９．水稻(X P _０１５６４５５８３．１);O s b H L H １５０．水稻(X P _０１５６２８１１７．１);黑色虚线框代表含有精氨酸/赖氨酸残基的保守区,可能与D N A 结合相关;白色矩形下面的区域代表蛋白基本区;黑色矩形下面的区域代表螺旋区;两者之间的黑线代表循环区;∗代表高度保守的区域图２㊀M t b H L H １４８与其他物种b H L H 蛋白保守性分析V v b H L H １４７．V i t i s v i n i f e r a (X P _００２２７９３０７．１);V v b H L H １４８．V i t i s v i n i f e r a (R VW ７１５９４．１);G m b H L H １４７．G l yc i n em a x (X P _００３５２９５１７．１);G m b H L H １４８．G l y c i n em a x (X P _００３５５０９１６．１,);M t b H L H １４７．M ed i c a go t r u n c a t u l a (X P _００３５９４７１８．１);M t b H L H １４８．M e d i c a g o t r u n c a t u l a (X P _００３６０９７９４．１);M t b H L H １４９．M e d i c a g o t r u n c a t u l a (X P _０１３４６９０７３．１);A t b H L H １４７．A r a b i d o ps i s (N P _５６６５６７．１);A t b H L H １４８．A r a b i d o p s i s (N P _５６６２８７．１);A t b H L H １４９．A r a b i d o p s i s (N P _５６３８３９．１);A t b H L H １５０．A r a b i d o ps i s (N P _５６６２６０．１);O s b H L H １４８．O r y z a s a t i v a (X P _０１５６２９２７７．１);O s b H L H １４９Ｇl i k e ．O r y z a s a t i v a (X P _０１５６４５５８３．１);O s b H L H １５０Ｇl i k e ．O r yz a s a t i v a (X P _０１５６２８１１７．１);T h e b l a c kd o t t e db o x r e p r e s e n t s t h e c o n s e r v e d r e g i o n c o n t a i n i n g A r g /L y s r e s i d u e s ,w h i c hm a y be i n v o l v e d i nD N A b i n d i n g ．T h e a r e ab e l o wt h ew h i t e r e c t a n g l e r e p r e s e n t s t h e b a s i c r e g i o nof t h e p r o t e i n ;T h e a r e ab e l o wt h e b l a c k r e c t a ng l e r e pr e s e n t s t h eh e l i xm o t i f ;T h e b l a c k l i n e b e t w e e n t h e t w o r e c t a n g l e s r e p r e s e n t s t h e l o o p r e g i o n ;∗R e p r e s e n t s ah i g h l y c o n s e r v a t i v e r e gi o n F i g ．２㊀C o n s e r v e da n a l y s i sb e t w e e n M t b H L H １４８p r o t e i na n db H L H s o f o t h e r s pe c i e s ７６９６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王菊萍,等:蒺藜苜蓿M t b H L H １４８转录因子的克隆与转化及其功能分析㊀㊀根据N C B I 在线软件B l a s t 到的亲缘关系接近且物种不同的蛋白,用邻接法构建系统进化树,研究其相互关系,系统发育树分析表明,M t b H L H １４８与大豆(b H L H １４７Ｇl i k e ㊁b H L H １４８Ｇl i k e )的亲缘关系最近,其次是拟南芥,其中一致性较高的是拟南芥的A I F ２和A I F ３基因(图３).蒺藜苜蓿M t b H L H １４８启动子序列分析表明(图４;表２),该基因的启动子区中含有启动子和增强子区域常见顺式作用元件C A A T Ｇb o x 以及核心启动子元件T A T A Ｇb o x ;作用元件中光响应元件数量最多,表明该蛋白响应光等外界环境信号;其次是MY B 结合位点;A B A 应答元件A B R E ,该蛋白可能在激素胁迫响应信号通路中占有重要的作用;除此之外,还含有参与细胞周期调节顺式作用元件,可能G m b H L H １４７Ｇl i k e ．大豆(X P _００３５２９５１７．１);G m b H L H １４８Ｇl i k e ．大豆(X P _００３５５０９１６．１);M t b H L H １４７．蒺藜苜蓿(X P _００３５９４７１８．１);M t b H L H １４８．蒺藜苜蓿(X P _００３６０９７９４．１);M t b H L H １４９．蒺藜苜蓿(X P _０１３４６９０７３．１);A t b H L H １４７．拟南芥(N P _５６６５６７．１);A t b H L H １４８．拟南芥(N P _５６６２８７．１);A t b H L H １４９．拟南芥(N P _５６３８３９．１);A t b H L H １５０．拟南芥(N P _５６６２６０．１);O s b H L H １４８．水稻(X P _０１５６２９２７７．１);O s b H L H １４９Ｇl i k e ．水稻(X P _０１５６４５５８３．１);O s b H L H １５０Ｇl i k e ．水稻(X P _０１５６２８１１７．１);Z m b H L H １４９．玉米(P W Z ０６３８６．１);Z b H L H １５０．玉米(X P _００８６７３６２９．１)图３㊀M t b H L H １４８与其他植物的系统进化树分析G m b H L H １４７Ｇl i k e ．G l y c i n e m a x (X P _００３５２９５１７．１);G m b H L H １４８Ｇl i k e ．G l y c i n em a x (X P _００３５５０９１６．１);M t b H L H １４７．M e d i c a go t r u n c a t u l a (X P _００３５９４７１８．１);M t b H L H １４８．M e d i c a g o t r u n c a t u l a (X P _００３６０９７９４．１);M t b H L H １４９．M e d i c a g o t r u n c a t u l a (X P _０１３４６９０７３．１);A t b H L H １４７．A r a b i d o p s i s (N P _５６６５６７．１);t b H L H １４８．A r a b i d o p s i s (N P _５６６２８７．１);A t b H L H １４９．A r a b i d o p s i s (N P _５６３８３９．１);A t b H L H １５０．A r a b i d o p s i s (N P _５６６２６０．１);s b H L H １４８．O r y z a s a t i v a (X P _０１５６２９２７７．１);O s b H L H １４９Ｇl i k e ．O r y z a s a t i v a (X P _０１５６４５５８３．１);O s b H L H １５０Ｇl i k e ．O r yz a s a t i v a (X P _０１５６２８１１７．１);Z m b H L H １４９．Z e am a ys (P W Z ０６３８６．１);Z b H L H １５０．Z e am a ys (X P _００８６７３６２９．１)F i g ．３㊀P h y l o g e n e t i c t r e e a n a l ys i s o fM t b H L H １４８a n db H L H s o f o t h e r s pe c i e s 参与了细胞周期的调控.因此,M t b H L H １４８蛋白能够响应光等环境信号和激素信号来调控蒺藜苜蓿的生长发育.２．２㊀亚细胞定位分析如图(图５)所示,空载的G F P 在整个细胞都有荧光信号,而M t b H L H １４８ＧG F P 在细胞核具有强烈的荧光信号,这也进一步说明了M t b H L H １４８定位在细胞核.２．３㊀M t b H L H １４８的表达分析利用q R T ＧP C R 分析M t b H L H １４８在不同组织中的表达分析,该基因在蒺藜苜蓿各组织中均有表达,叶中的表达量最低(以此为对照);在茎中的表达量最高,是叶的３．６倍;花中的表达量次之,是叶的２．２倍;根是叶的１．８倍(图６,A ).２００m m o l /LN a C l 胁迫下,地上部分表达量有一定的波动,在８h 表达量达到最高,是对照组的２倍.１２h 达到最低,是对照组的０．５倍(图６,B ).１００μm o l /LA B A处理下,M t b H L H １４８的表达量上调,在１２h 的表达量最高,是对照组的４倍(图６,B ).４ħ处理M t Ｇb H L H １４８表达量显著下调,处理２４h 的表达量最低,是对照组的０．１倍(图６,B ).２．４㊀转基因拟南芥T １代阳性鉴定及表达分析经筛选,共获得１６个抗性株系,经鉴定共获得１２图４㊀M t b H L H １４８启动子区序列以及标记的重要顺式作用元件F i g ．４㊀S e q u e n c e o f M t b H L H １４８p r o m o t e r r e g i o n a n d t h em a r k e d i m p o r t a n t c i s Ｇa c t i n g el e m e n t s ８６９西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷表２㊀M t b H L H １４８的启动子序列分析T a b l e ２㊀P r o m o t e r s e qu e n c e o f M t b H L H １４８顺式作用元件C i s Ｇa c t i n g el e m e n t 核心序列C o r e s e q u e n c e 功能F u n c t i o nC A A T Ｇb o x C A A T /C A A A T启动子和增强子区域常见顺式作用元件C o m m o n c i s Ｇa c t i n g e l e m e n t i n p r o m o t e r a n de n h a n c e r r e gi o n s T A T A Ｇb o x T A T A T A A /A T T A T A /T A T A转录起始区的核心启动子元件C o r e p r o m o t e r e l e m e n t a r o u n d Ｇ３０o f t r a n s c r i p t i o n s t a r t A B R E A C G T G /C A C G T G 脱落酸响应元件C i s Ｇa c t i n g e l e m e n t i n v o l v e d i n t h e a b s c i s i c a c i d r e s p o n s i v e n e s s M S A Ｇl i k e T C C A A C G G T 参与细胞周期调节的顺式作用元件C i s Ｇa c t i n g e l e m e n t i n v o l v e d i n c e l l c y c l e r e g u Ｇl a t i o n C C A A T Ｇb o x C A A C G G MY B H v １结合位点MY B H v １b i n d i n g s i t e MY Br e c o gn i t i o n s i t e C C G T T GMY B 结合位点MY Br e c o gn i t i o n s i t e G A Ｇm o t i f A T A G A T A A 光响应元件P a r t o f a l i g h t r e s p o n s i v e e l e m e n t G A T A Ｇm o t i f A A G A T A A G A T T 光响应元件P a r t o f a l i g h t r e s p o n s i v e e l e m e n t I Ｇb o xG A T A A G G G T 光响应元件P a r t o f a l i g h t r e s p o n s i v e e l e m e n t B o x I I C C A C G T G G C光响应元件P a r t o f a l i g h t r e s po n s i v e e l e m e n t G Ｇb o xC A C G T G /C T T C C A C G T G G C A/G C C A C G T G G A光响应元件C i s Ｇa c t i n g r e g u l a t o r y e l e m e n t i n v o l v e d i n l i g h t r e s po n s i v e n e ss B r i g h t ．明场下细胞的状态;C h l o r o p h yl l ．叶绿体自发荧光;G F P ．激光下G F P 自发荧光;M e r ge ．三者叠加效应显示细胞中发出G F P 荧光的位置图５㊀M t b H L H １４８的亚细胞定位B r i g h t ．T h e s t a t e o f c e l l s i n t h e f i e l d ;C h l o r o p h y l l ．C h l o r o p h y l l s p o n t a n e o u s f l u o r e s c e n c e ;G F P ．S po n t a n e o u s f l u o r e s c e n c e o fG F P u n d e r l a s e r ;M e r g e ．T h e s u p e r po s i t i o ne f f e c t o f t h e t h r e e f a c t o r s i n d i c a t e s t h e l o c a t i o no fG F P f l u o r e s c e n c e i nc e l l s F i g．５㊀S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no fM t b H L H １４８p r o t e i n 个过表达株系(图７,A ),对T １代转基因拟南芥叶片中M t b H L H １４８基因的表达量进行q R T ＧP C R 检测,选取其中表达量最高的转基因株系O E ８作为后续的实验材料用于基因的功能验证(图７,B ).２．５㊀转基因拟南芥耐盐性分析在盐胁迫下,对野生型拟南芥和T ２代转Mt Ｇb H L H １４８基因拟南芥种子进行发芽率测定;结果表明在０m m o l /LN a C l 条件下,转M t b H L H １４８基因拟南芥和野生型拟南芥(WT )最终发芽率基本一致,盐胁迫处理下,转基因苗和WT 的发芽率都受到了不同程度的抑制,１２５m m o l /LN a C l 胁迫处理下转基因拟南芥发芽率大于W T ,１５０m m o l /LN a C l 胁迫处理下转基因苗发芽率明显大于W T (图８).取１/２M S 固体培养基上萌发后生长５d 且长势一致的幼苗,进行盐胁迫处理１６d .对幼苗进行胁迫处理并统计根长,０m m o l /L N a C l 条件下,转基因苗和WT 长势一致.胁迫处理下转基因苗长势较好,侧根数量较多,根长明显大于W T (图９).在９６９６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王菊萍,等:蒺藜苜蓿M t b H L H １４８转录因子的克隆与转化及其功能分析A．M t b H L H １４８组织差异性表达,∗表示与根相比差异显著(P ＜０．０５);B ．M t b H L H １４８不同处理条件下的表达分析,∗表示相同的处理条件下与０h 相比差异显著(P ＜０．０５)图６㊀M t b H L H １４８基因在蒺藜苜蓿中的表达分析A．E x p r e s s i o na n a l y s i s i nd i f f e r e n t t i s s u e s ,∗m e a n s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e c o m pa r e dw i t h r o o t (P ＜０．０５);B ．A n a l y s i s o f t h e e x p r e s s i o n p a t t e r no f t h eM tb H L H １４８u n d e r d i f f e r e n t t r e a t m e n t s ,∗m e a n s s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e c o m pa r e dw i t h０hu n d e r t h e s a m e t r e a t m e n t (P ＜０．０５)F i g ．６㊀A n a l y s i s o f t h e e x pr e s s i o n p a t t e r no f t h eM t b H L H １４８i n M ．t r u n c a t u la A．D N A 水平鉴定B ．R N A 水平鉴定;O E １~O E １６为过表达株系,含有P C AM B I A ３３０１ＧM t b H L H １４８的质粒为正对照(C K＋),拟南芥野生型为负对照(C K Ｇ)图７㊀转基因拟南芥阳性鉴定A．D N Al e v e l i d e n t i f i c a t i o n ;B ．T r a n s c r i pt i o n a l l e v e l i d e n t i f i c a t i o n ;O E １~O E １６w e r e t r a n s g e n i c A r a b i d o p s i s ,p l a s m i d c o n t a i n i n gpC AM B I A ３３０１ＧM t b H L H １４８w e r e u s e d a s p o s i t i v e c o n t r o l (C K＋),w i l d Ｇt y p e ＧA r a b i d o p s i s w e r e u s e d a s n e ga t i v e c o n t r o l s (C K Ｇ)F i g．７㊀P o s i t i v e i d e n t i f i c a t i o no f M t b H L H １４８Ｇo v e r e x p r e s s i n g t r a n s g e n i c p l a n t s i n A r a b i d o ps i s １２５m m o l /LN a C l 胁迫处理下,转基因苗的根长大于对照组,长度为对照组的１．５倍(图１０),表现出了明显的抗盐性.３㊀讨㊀论本研究从蒺藜苜蓿中克隆到M t b H L H １４８基因,蛋白与大豆同源性最近且含有典型的b H L H 结构域,属于b H L H 转录因子家族.B u r l e y 等[２６]研究发现,b H L H 转录因子含有保守的精氨酸/赖氨酸残基结构域,该结构域在识别D N A 序列并与之结合过程中发挥着重要作用;此外,A d r i a n 等[２７]发现b H L H 转录因子含有典型的b H L H 结构域(有助于蛋白的二聚化以及识别靶D N A 序列),该结构域高度保守.这与本研究结果一致.M t b H L H １４８亚细胞定位分析结果表明,该基因与大多数转录因子一致[２８],定位在细胞核[２９].本研究用４ħ处理蒺藜苜蓿３６h 后,M t b H L H １４８基因表达量显著下调.S o n g 等[３０]研究发现冷处理１２h 后,白菜B r a b H L H １４８的表达量是对照组的２０倍以上,B r a b H L H １４８可能在寒冷中发挥重要的正向调控作用.本研究结果表明低温处理后蒺藜苜蓿M t b H L H １４８基因与上述结果相反,可能该基因在冷胁迫中发挥负向调控作用.在不同物种中,该基因具有不同的表达响应,说明不同物种具有生物特异性,需要针对特定物种进行分析.植物激素脱落酸(A B A )控制着植物的一系列生理过程[３１],能够调节水分平衡和渗透胁迫耐受性[３２],使植物细胞即使在应激条件下也能保持稳态[３３].S e o 等[２１]研究发现,A B A 胁迫处理时,水稻O s b H L H １４８基因的表达量上调,这与本研究结果相０７９西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷A．０m m o l /LN a C l ;B ．１２５m m o l /LN a C l ;C ．１５０m m o l /LN a C l 图８㊀不同浓度盐胁迫下转基因拟南芥的发芽率A．０m m o l /LN a C l ;B ．１２５m m o l /LN a C l ;C ．１５０m m o l /LN a C lF i g ．８㊀G e r m i n a t i o n r a t eu n d e r s a l t t r e a t m e n t o f t r a n s g e n i c A r a b i d o ps is WT．野生型拟南芥;O E ８．T ２代转基因拟南芥图９㊀野生型和转基因拟南芥在不同盐浓度下的长势WT．W i l d t y p e A r a b i d o p s i s ;O E ８．T ２t r a n s g e n i c A r a b i d o ps i s F i g ．９㊀G r o w t ho fw i l da n d t r a n s g e n i c A r a b i d o ps i s u n d e r d i f f e r e n t s a l t c o n c e n t r a t i o n s t r e a t m e n ts ∗表示相同盐浓度下O E ８与WT 相比差异显著(P ＜０．０５)图１０㊀不同浓度盐胁迫下转基因拟南芥的根长∗m e a n s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e c o m pa r e dO E ８w i t h WT a t t h e s a m e s a l t t r e a t m e n t (P ＜０．０５)F i g ．１０㊀R o o t l e n gt hu n d e r s a l t t r e a t m e n t o f t r a n s g e n i c A r a b i d o ps i s 同.同时启动子分析显示,M t b H L H １４８基因启动子区含有典型的A B A 应答元件A B R E ,A B A 处理后表达量呈现上升趋势,该基因可能参与了A B A 胁迫响应途径.本研究用２００m m o l /L N a C l 处理蒺藜苜蓿,M t b H L H １４８基因在盐胁迫后初期表达量升高,该基因可能参与盐胁迫响应途径.M u s aK a v a s 等[１３]研究发现盐处理后,P v b H L H １４８在菜豆根组织和叶组织中均上调,表达水平较对照高,这与本研究结果相同.生物信息学分析表明,M t b H L H １４８与拟南芥的A I F ２的同源性最近.在盐胁迫处理６h 后,拟南芥中A I F ２基因的表达量明显上调[２３],这同样与本研究结果一致.由此表明,该基因参与盐胁迫响应途径.Q i n gm e i 等[２３]还发现过表达A I F ２基因同样能够增强转基因拟南芥的耐盐性.在本研究中,通过对转基因拟南芥以及野生型拟南芥耐盐性分析发现,１２５m m o l /L N a C l 胁迫处理下,与野生１７９６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王菊萍,等:蒺藜苜蓿M t b H L H １４８转录因子的克隆与转化及其功能分析型相比,转M t b H L H１４８基因拟南芥发芽率及根长明显增加,进一步说明了转基因拟南芥耐盐性得到提高.因此,M t b H L H１４８基因可能在拟南芥盐胁迫调节机制中起到一定的调控作用.该基因是转录因子,后续实验应深入分析其在豆科模式植物蒺藜苜蓿中的抗盐反应机理,以期为苜蓿的抗逆育种服务.参考文献:[１]㊀刘晓月,王文生,傅彬英．植物b H L H转录因子家族的功能研究进展[J]．生物技术进展,２０１１,１(６):３９１Ｇ３９７．L I U X Y,WA N G W S,F U B Y．R e s e a r c h p r o g r e s so f p l a n tb H L Ht r a n sc r i p t i o n f a c t o r f a m i l y[J]．C u r r e n t B i o t e c h n o l o g y,２０１１,１(６):３９１Ｇ３９７．[２]㊀J O L MA A,Y I N Y M,N I T T A K R,e t a l．D N AＧd e p e n d e n tf o r m a t i o no f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r p a i r s a l t e r s t h e i r b i n d i ng s p eＧc i f i c i t y J]．N a t u r e,２０１５,５２７(７５７８):３８４Ｇ３８８．[３]㊀F E L L E R A,MA C H E M E R K,B R A U N E L,e t a l．E v o l uＧt i o n a r y a n dc o m p a r a t i v ea n a l y s i so f MY B a nd b H L H p l a n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s[J]．T he P l a n t J o u r n a l:f o r C e l l a n dM oＧl e c u l a rB i o l og y,２０１１,６６(１):９４Ｇ１１６．[４]㊀罗赛男,杨国顺,石雪晖,等．转录因子在植物抗逆性上的应用研究[J]．湖南农业大学学报(自然科学版),２００５,３１(２):２１９Ｇ２２３．L U OSN,Y A N GGS,S H I X H,e t a l．O n t h e a p p l i c a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r t o p l a n t s t r e s s r e s i s t a n c e[J]．J o u r n a l o fH u n a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e s),２００５,３１(２):２１９Ｇ２２３．[５]㊀MA P C,R O U L D M A,W E I N T R A U B H,e t a l．C r y s t a l s t r u c t u r eo fM y o Db H L Hd o m a i nＧD N Ac o m p l e x:P e r s p e c t i v e s o nD N Ar e c o g n i t i o n a n d i m p l i c a t i o n s f o r t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v aＧt i o n[J]．C e l l,１９９４,７７(３):４５１Ｇ４５９．[６]㊀N A I RS K,B U R L E Y S K．R e c o g n i z i n g D N Ai nt h e l i b r a r y [J]．N a t u r e,２０００,４０４(６７７９):７１５Ｇ７１７,７１８．[７]㊀A T C H L E Y W R,T E R HA L L E W,D R E S SA．P o s i t i o n a l d eＧp e n d e n c e,c l i q u e s,a n d p r e d i c t i v em o t i f s i n t h eb H L H p r o t e i nd o m a i n[J]．J o u r n a l o f M o le c u l a rE v o l u t i o n,１９９９,４８(５):５０１Ｇ５１６．[８]㊀C A S T E L A I N M,L E H I R R,B E L L I N IC．T h en o nＧD N AＧb i n d i n g b H L H t r a n sc r i p t i o nf a c t o rP R E３/b H L H１３５/A T B S１/T MO７i s i n v o l v e d i nt h e r e g u l a t i o no f l i g h t s i g n a l i n gp a t h w a y i n A r a b i d o p s i s[J]．P h y s i o l o g i aP l a n t a r u m,２０１２,１４５(３):４５０Ｇ４６０．[９]㊀A B E H,U R A O T,I T O T,e ta l．A r a b i d o p s i s A t MY C２(b H L H)a n dA t MY B２(MY B)f u n c t i o na s t r a n s c r i p t i o n a l a c t iＧv a t o r s i na b s c i s i c a c i ds i g n a l i n g[J]．T h eP l a n tC e l l,２００３,１５(１):６３Ｇ７８．[１０]㊀F R I E D R I C H S E N D M,N E MHA U S E RJ,MU R AM I T S U T,e ta l．T h r e er e d u n d a n tb r a s s i n o s t e r o i de a r l y r e s p o n s eg e n e se n c o d e p u t a t i v eb H L H t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sr e q u i r e df o r n o r m a lg r o w t h[J]．G e n e t i c s,２００２,１６２(３):１４４５Ｇ１４５６．[１１]㊀P I R E SN,D O L A NL．O r i g i na n dd i v e r s i f i c a t i o no f b a s i cＧh eＧli xＧl o o pＧh e l i x p r o t e i n s i n p l a n t s[J]．M o l e c u l a rB i o l o g y a n dE v o l u t i o n,２０１０,２７(４):８６２Ｇ８７４．[１２]㊀王㊀翠,兰海燕．植物b H L H转录因子在非生物胁迫中的功能研究进展[J]．生命科学研究,２０１６,２０(４):３５８Ｇ３６４．WA N GC,L A N H Y．R e s e a r c h p r o g r e s s e so nf u n c t i o n so fp l a n t b H L Ht r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n v o l v e d i na b i o t i c s t r e s s e s[J]．L i f e S c i e n c eR e s e a r c h,２０１６,２０(４):３５８Ｇ３６４．[１３]㊀B A I L E YPC,MA R T I NC,T O L E D OＧO R T I ZG,e t a l．U pＧd a t eo nt h eb a s i che l i xＧl o o pＧh e l i xt r a n s c r i p t i o nf a c t o rg e n ef a m i l y i n A r a b i d o p s i s t h a l i a n a[J]．T h e P l a n t C e l l,２００３,１５(１１):２４９７Ｇ２５０２．[１４]㊀S U N X,WA N G Y,S U IN．T r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o no fb H L Hd u r i n gp l a n t r e s p o n s e t os t r e s s[J]．B i oc h e m i c a l a n dB i o p h y s i c a l R e s e a r c hC o m m u n i c a t i o n s,２０１８,５０３(２):３９７Ｇ４０１．[１５]㊀I K E D A M,M I T S U D A N,O HM EＧT A K A G IM．A T B S１I NＧT E R A C T I N G F A C T O R s n e g a t i v e l y r e g u l a t e A r a b i d o p s i sc e l le l o n g a t i o ni n t h et r i a n t a g o n i s t i c b H L H s y s t e m[J]．P l a n t S i g n a l i n g&B e h a v i o r,２０１３,８(３):e２３４４８．[１６]㊀E N D O T,F U J I IH,S U G I Y AMA A,e t a l．O v e r e x p r e s s i o n o f a c i t r u s b a s i c h e l i xＧl o o pＧh e l i x t r a n s c r i p t i o n f a c t o r(C u b H L H１),w h i c hi sh o m o l o g o u st o A r a b i d o p s i sa c t i v aＧt i o nＧt a g g e db r i１s u p p r e s s o r１i n t e r a c t i n g f a c t o r g e n e s,m o d uＧl a t e s c a r o t e n o i d m e t a b o l i s mi nt r a n s g e n i c t o m a t o[J]．P l a n tS c i e n c e:a nI n t e r n a t i o n a lJ o u r n a lo f E x p e r i m e n t a l P l a n tB i o l o g y,２０１６,２４３:３５Ｇ４８．[１７]㊀T O T S U K A A,O K AM O T OE,M I Y A HA R A T,e t a l．R eＧp r e s s e d e x p r e s s i o no f a g e n e f o r ab a s i ch e l i xＧl o o pＧh e l i x p r oＧt e i nc a u s e s aw h i t e f l o w e r p h e n o t y p e i n c a r n a t i o n[J]．B r e e dＧi n g S c i e n c e,２０１８,６８(１):１３９Ｇ１４３．[１８]㊀H E I S L E R M G,A T K I N S O N A,B Y L S T R A Y H,e t a l．S P A T U L A,a g e n e t h a t c o n t r o l s d e v e l o p m e n t o f c a r p e lm a rＧg i n t i s s u e s i n A r a b i d o p s i s,e n c o d e s a b H L H p r o t e i n[J]．D eＧv e l o p m e n t(C a m b r i d g e,E n g l a n d),２００１,１２８(７):１０８９Ｇ１０９８．[１９]㊀R A J A N IS,S U N D A R E S A N V．T h e A r a b i d o p s i s m y c/b H L H g e n eA L C A T R A Ze n a b l e sc e l l s e p a r a t i o n i n f r u i td eＧh i s c e n c e[J]．C u r r e n tB i o l o g y:C B,２００１,１１(２４):１９１４Ｇ２７９西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷。

蒺藜苜蓿MtFVE基因功能初步解析王瑞良;张鹏程;牛丽芳;朱昊;李学森;王兴春;林浩【摘要】拟南芥(Arabidopsis thaliana)中自主通路成员FLOWERING LOCUS VE(FVE)主要通过表观遗传学机制抑制其下游开花抑制子FLOWERING LOCUS C(FLC)的表达从而促进开花,但有研究发现蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中没有FLC的同源基因,因此,蒺藜苜蓿中FVE同源基因调控开花时间的分子作用机理还有待研究.通过生物信息学方法在蒺藜苜蓿中筛选到2个拟南芥FVE的同源蛋白,将其分别命名为MtFVEa和MtFVEb.经氨基酸序列比对发现,2个蛋白均具有典型的WD40蛋白结合结构域.随后通过qRT-PCR和半定量RT-PCR检测MtFVEa和MtFVEb基因组织表达特异性,发现2个基因在花和营养生长期的茎尖具有较高水平的表达.经酵母双杂实验进一步分析发现,MtFVEa蛋白与MtFLD[拟南芥FLOWERING LOCUS D(FLD)的同源蛋白]和MtHDA6[拟南芥histone deacetylase 6(HDA6)的同源蛋白]均发生蛋白互作,表明MtFVE可能同样形成FVE-FLD-HDA6三元复合体参与蒺藜苜蓿开花调控.研究结果为进一步探索蒺藜苜蓿MtFVE基因的功能提供了研究思路和理论支持.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2019(009)002【总页数】9页(P152-160)【关键词】蒺藜苜蓿;MtFVE;FVE-FLD-HDA6【作者】王瑞良;张鹏程;牛丽芳;朱昊;李学森;王兴春;林浩【作者单位】山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;新疆畜牧科学院草业研究所,乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院草业研究所,乌鲁木齐830000;山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081【正文语种】中文开花是高等植物实现世代交替的重要环节。

·25·２０１７年第６期25行业发展近日，中国农业科学院生物技术研究所在植物次生代谢物生物合成调控机制研究方面取得新进展，发现了MYB3转录因子调控苯丙氨酸合成新分子机制。

相关研究成果于5月8日在线发表在国际著名的植物学杂志《植物生理学（Plant Physiology）》上。

植物能够合成各种次生代谢物，包括生物碱、萜类、黄酮类、硫代葡萄糖苷等。

这些次生代谢物在植物适应环境的过程中扮演着非常重要的角色，它们参与调控植物的品质、生长发育、生物和非生物胁迫等各种生理生化过程，而R2R3-MYB 类转录因子在调控苯丙烷类次生代谢生物合成中起到重要的作用。

在拟南芥MYB 转录因子中，第4亚类的MYB3、MYB4、MYB7、MYB32转录因子因含有EAR 抑制基序而具有转录抑制活性，但是其调控基因表达的分子机理尚未阐述清楚。

研究团队前期的研究结果发现了MYB4、MYB7、MYB32因子与细胞核膜蛋白SAD2相互作用，定点突变分析发现了MYBs 蛋白保守基序GY/FDFLGL 的天冬氨酸（Asp，D）在蛋白相互作用中起到了重要作用，这种互作使得MYBs 蛋白能够进入细胞核从而调控基因的表达，这一结果发表在《植物杂志（The Plant Journal）》上。

在前期的基础上，进一步研究发现，MYB3的调控机制与MYB4、MYB7、MYB32完全不一样，酵母双杂交实验发现MYB3能够与LNK 蛋白家族成员LNK1和LNK2相互作用，这种互作依赖于LNK 蛋白C 端的保守基序R1和R2，定点突变发现保守基序R1和R2中的天冬氨酸（Asp，D）在互作中起到重要的介导作用，转录激活检测分析证明了LNK1和LNK2通过其N 端的ENT 结构域来调控MYB3的抑制子功能，上述研究工作深入揭示了MYB 抑制子调控植物次生代谢物生物合成的分子机制，为植物代谢工程和品质改良提供了重要的理论基础。

该论文以生物所为第一完成单位，周美亮副研究员为第一作者，周美亮副研究员和吴燕民研究员为共同通讯作者。

MYB转录因子功能与调控研究进展郭弘光;吴繁花【摘要】综述了MYB蛋白家族的结构、功能和调控机制的研究进展,为分析、预测和阐明植物多物种中的NYB家族成员的功能打下良好的基础.%The structure,functions and regulation mechanisms of MYB protein were summarized,laying foundation for analyzing,predicting and e-lucidating the MYB proteins in plant species.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)020【总页数】4页(P10381-10383,10516)【关键词】MYB;结构和功能;转录因子;调控【作者】郭弘光;吴繁花【作者单位】海南大学农学院,海南海口570228;海南大学农学院,海南海口570228【正文语种】中文【中图分类】S188;Q943植物MYB转录因子家族是功能多样、数量众多的转录因子之一，参与调控植物发育、代谢和对生物与非生物胁迫的反应等多种生理过程。

1987年，从玉米谷粒糊粉中克隆了COLORED1（C1）基因，编码一个具有MYB结构域的蛋白，参与花青素合成［1］。

拟南芥基因组测序成功后，第一次全面地对植物MYB基因家族进行描述和分类，为系统研究MYB转录因子家族在植物中的作用打下良好基础［2－3］。

目前，随着遗传学和分子生物学方法的应用，已在拟南芥、大豆［4］、玉米、水稻、葡萄、杨树等多种植物物种中研究了MYB蛋白家族成员的功能。

在控制MYB蛋白活性的调控机制、基因表达规律和靶标基因研究中取得一定进展［5－7］。

然而，MYB结构域中仅有少数DNA结合位点的功能得到阐明。

因此，笔者综述了MYB转录因子家族的分类、结构、生物功能以及调控机制的最新进展，结合更多的植物基因组测序结果，以阐明这一大类转录因子的进化规律和家族各成员的功能。

茉莉酸调控次生代谢的原理茉莉酸是植物中一种重要的激素，具有调控植物次生代谢的能力。

次生代谢是指植物细胞合成、存储并在植物发生压力、伤害或环境变化时释放的化合物。

茉莉酸通过调节次生代谢物的合成、存储和释放来参与植物的生长发育、抵御外界胁迫等过程。

茉莉酸的调控作用主要通过两个途径实现：茉莉酸信号传导途径和茉莉酸诱导基因表达途径。

茉莉酸信号传导途径是通过感应茉莉酸并转导信号的分子组成的信号途径。

茉莉酸受体（jasmonate receptors）是茉莉酸信号传导途径的核心组分。

茉莉酸受体包括COI1（CORONATINE INSENSITIVE1）等。

当茉莉酸结合到茉莉酸受体上时，激活受体，并与其他下游信号分子相互作用，最终形成信号传导链。

信号传导链上的分子包括JAZ蛋白（jasmonate ZIM-domain），MYC转录因子（MYC transcription factors）等。

JAZ蛋白在茉莉酸未结合受体时与MYC转录因子结合并抑制其活性，形成茉莉酸信号的负调节。

当茉莉酸结合受体时，茉莉酸受体与JAZ蛋白结合，促进JAZ蛋白的降解，从而解除MYC转录因子的抑制，促进转录因子的活性，引发下游靶基因的表达。

这些靶基因编码了一系列参与次生代谢的关键酶，进而调控次生代谢物的合成。

茉莉酸诱导基因表达途径是通过茉莉酸诱导基因表达来调控次生代谢物合成的过程。

茉莉酸可以直接或间接地影响一系列转录因子的表达，进而调控靶基因的表达。

例如，茉莉酸能够激活WRKY（WRKY domain-containing）家族转录因子的表达，WRKY转录因子与WRKY结合因子结合，在次生代谢物合成途径上起到调节作用。

此外，茉莉酸还能够通过激活MYB（MYB domain-containing）转录因子的表达，进一步参与次生代谢物的合成。

茉莉酸调控植物次生代谢的原理可以总结如下：茉莉酸通过茉莉酸受体与下游信号分子相互作用，最终促进了茉莉酸信号的传导。

Botanical Research 植物学研究, 2020, 9(3), 217-225Published Online May 2020 in Hans. /journal/brhttps:///10.12677/br.2020.93026Research Progress in Anabolic ControlMechanisms of Plant CarotenoidsYuanyuan Wu, Yufeng Yu, Yihui WangZhejiang Normal University, Jinhua ZhejiangReceived: Apr. 7th, 2020; accepted: May 18th, 2020; published: May 25th, 2020AbstractCarotenoids are a kind of natural functional pigments. The anabolic regulation of carotenoids in plants is a complex process regulated by many levels and factors. This article describes that the transcriptional level, environmental factors, plastid development, and hormones regulate the ac-cumulation of carotenoids in plants.KeywordsPlant, Carotenoids, Anabolism, Regulatory Mechanism植物类胡萝卜素合成代谢调控机制研究进展吴园园，于玉凤，王怡惠浙江师范大学，浙江金华收稿日期：2020年4月7日；录用日期：2020年5月18日；发布日期：2020年5月25日摘要类胡萝卜素是一种天然的功能性色素，植物中类胡萝卜素合成代谢调控是个复杂的过程，受多层次、多水平因素的调控；本文阐述了转录水平、环境因子、质体发育和激素对植物积累类胡萝卜素的调控机制。

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(2): 374−379/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家自然科学基金项目(30771527)和教育部博士点基金项目(20060466004)资助。

*通讯作者(Corresponding author): 王成章, E-mail: wangchengzhang@第一作者联系方式: E-mail: zhujianming311@, Tel: 150********Received(收稿日期): 2010-05-28; Accepted(接受日期): 2010-09-22.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00374紫花苜蓿光敏色素B基因片段克隆及RNA干扰表达载体的构建朱见明严学兵史莹华王成章*河南农业大学牧医工程学院, 河南郑州 450002摘要: 根据紫花苜蓿2级标准品种Vernal PhyB基因的序列(GenBank登录号为GQ379903.1), 设计2对含有酶切位点的特异性引物F1/R1和F2/R2, 以紫花苜蓿总RNA为模板, 通过RT-PCR法扩增得到PhyB基因正向、反向目的片段, 将片段连接到pGEM-T Easy载体上得到重组载体pGEMB-1和pGEMB-2, 再以中间载体pHANNIBAL和植物双元表达载体pART27为基础, 通过多次酶切和连接, 成功地构建了紫花苜蓿PhyB的RNAi表达载体。

为进一步研究光敏色素B与苜蓿秋眠性之间的关系奠定了基础。

关键词: 紫花苜蓿; 秋眠性; 光受体; 光敏色素; RNA干扰Cloning of Medicago sativa Phychrome B cDNA and Establishment of Its RNA Interference Expression VectorZHU Jian-Ming, YAN Xue-Bing, SHI Ying-Hua, and WANG Cheng-Zhang*Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, ChinaAbstract:The short day is one of the main factors affecting alfalfa fall dormancy, which is called as the photoperiodic effect. Study on the relationship between the main photoreceptors-PhyB gene and alfalfa fall dormancy may reveal the regulation mechanism of alfalfa fall dormancy radically, and provide a scientific reference for the application of alfalfa varieties differing in fall dormancy in forage production. The objective of this study was to establish an RNAi expression vector harboring PhyB gene of Medicago sativa. Two pairs of specific primers containing different enzyme sites were designed on the basis of PhyB gene sequence of alfalfa variety “Vernal” (GenBank accession number: GQ379903.1). With the template of total RNA, positive sense strand and antisense strand were amplified by RT-PCR and cloned into pGEM-T Easy vector to obtain recombinant vectors pGEMB-1 and pGEMB-2, then based on the intermediate vector pHANNIBAL and the plant binary expression vector pART27, we constructed the RNAi expression vector pART27-RNAi containing a hairpin structure by many times of enzyme digestion and connection. The results provide a foun-dation for further studying the relationship between alfalfa dormancy and PhyB.Keywords:Medicago sativa; Fall dormancy; Photoreceptor; Phytochrome; RNA interference苜蓿秋眠性(fall dormancy, FD)是苜蓿在秋季因日照长度变短和气温下降时所表现出的一种适应性生长特性[1], 是栽培苜蓿选择品种时考虑的首要指标[2]。