人胰岛素样生长因子Ⅰ型在E.coli和家蚕中的表达
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第２０卷第４期 ２００６年７月
常熟理工学院学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈａｎｇｓｈｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．２０ Ｎｏ．４
Ｊｕｌｙ．２００６
人胰岛素样生长因子工型在Ｅ．ｅｏｌｉ和家蚕中的表达 徐岩，贡成良，薛仁宇，沈卫德，曹广力 （苏州大学生命科学学院，江苏苏州２１５１２３） 摘 要：将ｈＩＧＦ—Ｊ基因克隆进原核表达栽体ｐＥＴ一２８ａ（４－），在Ｅ．ｃｏｌｉ中进行了融合表达，Ｗｅｓｔ－ ｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ显示在２６ ｋＤ附近有一务特异奈带。将ｈｌＧＦ—Ｉ基因克隆进ｐＢａｃＰＡＫ一８，获得了杆状病 毒转移栽体ｐＢａｃＰＡＫ一８一ＩＧＦ—Ｉ，在脂质体的介导下，与线性化的家蚕杆状病毒共转染家蚕培养 细胞Ｂｍ—Ｎ，经空斑筛选，ＰＣＲ检测，获得了重组病毒Ｂｍ—Ｂａｃ—ｈｌＧＦ—Ｉ。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测表明， 在感染重组病毒后，家蚕幼虫血淋巴中可以检测到一务分子量约为７．５ ｋＤ的特异性条带，ＥＬＩＳＡ检 测表达量达４．５１ ｒ，／ｍＬ蚕血淋巴。 关键词：人重组胰岛素样生长因子Ｉ型；大肠杆茵；家蚕；重组病毒；基因表达 中图分类号：￥８８４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—２７９４（２００６）０４—００７２—０６
胰岛素样生长因子Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＩＧＦ—Ｉ）是一类具有细胞分化和增殖功能，并具有胰岛 素样作用的多肽…。目前发现胰岛素样生长因子有两种，分别为ＩＧＦ—Ｉ和ＩＧＦ—ＩＩ，ＩＧＦ系统包括两个配基 及其受体和结合蛋白 Ｊ。ＩＧＦ—Ｉ基因结构上与胰岛素原具有高度的同源性，因具有类似胰岛素的作用而得 名，ＩＧＦ—Ｉ是含有７Ｏ个氨基酸的碱性肽，相对分子质量为７６５０，等电点８．４［３ Ｊ。ＩＧＦ—Ｉ在活体内外能促进 多种细胞的生长和分化，是生长激素功能的主要辅助调节因子，并且具有类似胰岛素的降血糖活性，由于 ＩＧＦ—Ｉ型生长因子的多功能性，使其具有很多潜在的治疗作用，在治疗骨质疏松、骨折、侏儒症、糖尿病、溃 疡、各种烧伤、创伤及神经末梢损伤等疾病方面具有重要应用价值 ］。 由于成熟ＩＧＦ—Ｉ在人血内的含量不高，直接从血液中提纯的技术难度大。缺少ＩＧＦ—Ｉ纯制品已经成 为人们对其生物学功能和临床应用研究的主要障碍。家蚕杆状病毒表达系统是一类高效真核表达系统，与 大肠杆菌等其他系统相比，具有产量高、生物活性高、安全等优点，是基因工程产品制备的理想系统［ｓＩ７］。为 了提高ｈｌＧＦ—Ｉ的表达水平同时保证其完整的生物学活性，也为了深入了解带有ｈＩＧＦ—Ｉ信号肽序列的 ｅＤＮＡ基因在家蚕表达蛋白中的加工方式，我们用同源重组的方式，将具有完整ＯＲＦ的，其大小为５８８ｂｐ的 ｈｌＧＦ一工的全长ｅＤＮＡ插入家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）中，获得了重组的杆状病毒，以家蚕幼虫为宿主， 实现了ｈｌＧＦ一工的高效表达，为解决上述难题提供了一条途径。
１材料和方法 １．１材料 １．１．１菌种、质粒、细胞
收稿日期：２００６ ０４—１０ 摹金项目：国家霉点基础研究发展计划（９７３计划）资助项目（２００５ＣＢ１２１０００），国家自然科学基金资助项目（３０５７１４０４）。 作者简介：徐岩（１９８ｌ一），男，江苏盐城人，苏州大学生命科学学院硕士研究生。
维普资讯 http://www.cqvip.com 第４期 徐岩贡成良 薛仁宇，等：人胰岛素样生长因子Ｉ型在Ｅ．ｃｏｌｉ和家蚕中的表达 ７３ 大肠杆菌ＴＧ１、ＢＬ２１、表达载体ｐＥＴ一２８ａ（＋）、转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８、家蚕ＢｍＮ细胞和线性化家蚕核型多 角体病毒Ｂｍ—ＢａｃＰＡＫ６为本实验室保存。带有ｈＩＧＦ—Ｉ完整ｃＤＮＡ基因（基因序列与ＧｅｎＢａｎｋ的Ｍ１１５６８ 序列中１８４—７７０一致）的质粒ｐＳＫ—ＩＧＦ为苏州大学生命科学学院基因工程实验室保存。 １．１．２酶及主要试剂 限制性内切核酸酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、蛋白质Ｍａｒｋｅｒ为ＭＢＩ公司产品；ＴＣ一１００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、胎牛血清均为 ＧＩＢＣＯ—ＢＲＬ公司产品；ＬＭＰ为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；聚丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、ＴＥＭＥＤ为Ｓｉｇｍａ公司产 品；ＰＣＲ试剂为上海生工产品。其余试剂均为国产分析纯。 ｈ１ＧＦ—Ｉ ＥＬＩＳＡ试剂盒购自Ｒ＆Ｄ公司。Ｈｉｓ６抗体为Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ公司产品。辣根过氧化物酶标山羊 抗小鼠抗体为ＺＹＭＥＤ公司产品。 １．１．３引物 引物由上海博亚生物工程有限公司合成，分别为５’一ＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧ一３’，５’一ＡＡ． ＧＡＡＴｒＣＴＣＡＴＩＴｒＣＣ一３’，下划线分别示ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ位点。 １．２ 方法 １．２．１基因操作 质粒提取、酶切、连接、转化、鉴定等按Ｓａｍｂｒｏｏｋ实验手册［８】略加修改进行。 １．２．２原核表达载体的构建 合成ｈｌＧＦ—Ｉ的引物序列两端设计有ＢａｒｎＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ位点，ＰＣＲ产物经酶切后，克隆进ｐＥＴ一２８ａ的 ＢａｒｎＨＩ、ＥｃｏＲＩ位点，获原核表达载体ｐＥＴ一２８ａ—ｈＩＧＦ—Ｉ。 １．２．３重组杆状病毒转移载体的构建 ＰＣＲ合成的ｈＩＧＦ—Ｉ经ＢａｒｎＨ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｉ酶切，克隆至ｐＢａｃＰＡＫ８中，经ＥｃｏＲ Ｉ和ＢａｒｎＨ Ｉ酶切鉴定 后，获得ｐＢａｃＰＡＫ８一ｈＩＧＦ—Ｉ。 １．２．４ Ｅ．ｃｏｌｉ的诱导表达 将重组的ｐＥＴ一２８ａ—ｈＩＧＦ—Ｉ ＤＮＡ转化至Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＩ２１中，转化菌以１：１００接种于含有卡那霉素的ＬＢ 培养基中，３７℃培养３ ｈ，加入ＩＰＴＧ至终浓度为１ｍｍｏＬ／ｍＬ，进行诱导表达３ ｈ。 １．２．５重组病毒构建 将生长状态良好的ＢｍＮ细胞种于２５ｃｍ２培养瓶中，细胞密度为１×１０ ／ｍＬ，２７℃培养３ ｈ使细胞贴壁。 病毒Ｂｍ—ＢａｃＰＡＫ６ ＤＮＡ的制备参照Ｓｕｍｍｅｒｓ实验手册 Ｊ进行，取线性化Ｂｍ—ＢａｃＰＡＫ６（１ ｇ），与ｐＢａｃＰＡＫ８一 ｈＩＧＦ—Ｉ（２ ｇ）采用脂质体Ｈｐｏｆｅｃｔｉｎ介导法共转染ＢｍＮ细胞。共转染培养液进行空斑纯化，通过空斑法并 根据蓝白斑及ＰＣＲ结果，筛选重组杆状病毒Ｂｍ—Ｂａｃ—ｈＩＧＦ—Ｉ，并在细胞中扩增后待用。 １．２．６重组病毒在家蚕中的表达以及初步鉴定 以昆虫针蘸取重组病毒液（＞２×１０。ｐｆｕ／ｍＬ），在五龄起蚕（菁松×皓月品种）后腹部环节处穿刺接种，感 染重组病毒的３ ｄ（７２ ｈ）至５ ｄ（１２０ ｈ）间，每天收集家蚕血淋巴。取部分５ ｄ样品在高倍显微镜下观察是否存 在多角体，另取部分５ ｄ样品抽提蚕血淋巴总ＤＮＡ，进行ＰＣＲ鉴定。其余各样品离心收集上清备用。并取接 种了线性化病毒Ｂｍ—ＢａｃＰＡＫ６后５ ｄ的家蚕幼虫血淋巴，经同样离心处理后作为对照样品一２０℃保存备用。 １．２．７ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ与Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ参照Ｌａｅｍｍｌｉ法ｎ０Ｊ进行，ＩＰＴＧ诱导表达及对照菌各取１．５ ｍＬ，经离心后收集菌体，加１００ ｔｔＬ ＴＥ缓冲液悬浮，反复冻融后与ＳＤＳ凝胶上样缓冲液等比例混合，ＩＯ０￣Ｃ煮沸５ ｍｉｎ，取ｌ０｜ＩＬ进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ （分离胶ｌ２．５％，浓缩胶５％）电泳。将感染重组病毒及对照病毒的家蚕血淋巴上清（稀释３倍）与ＳＤＳ凝胶 上样缓冲液等比例混合，１００Ｔ：煮沸５ ｒａｉｎ，取ｌ０ 进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ（分离胶ｌ５％，浓缩胶５％）电泳。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ参照文献［１１］进行。
２ 结 果 ２．１ ｈｌＧＦ—Ｉ在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达
维普资讯 http://www.cqvip.com ７４ 常熟理工学院学报 ２０ｏ６年 将ＢａｒｎＨ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｉ酶切鉴定重组质粒，获表达质粒ｐＥＴ一２８ａ—ｈＩＧＦ—Ｉ（图１），将该质粒转化Ｅ．ｃｏｌｉ 受体菌ＢＬ２１，并用ＩＰＴＧ诱导表达。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测表明，重组蛋白的分子量约２６ ｋＤ，与 推测的融合蛋白的分子量一致（图２），表明外源基因得到表达，但未能得到加工，即未能去除信号肽及Ｃ一端 氨基酸残基；而从ＳＤＳ—ＰＡＧＥ结果中未见明显特异条带，表明在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达量可能不高。通过ＥＬＩＳＡ 检测未见明显活性，可能与表达蛋白的折叠、未加工等原因有关。
：２［】３：２１２
ｈｈｐ
。
Ａ Ｂ 图ｌ表达质粒ｐＥＴ一２８ａ—ｈｌＧＦ—Ｉ的酶切鉴定 图２ ｈｌＧＦ—Ｉ在大肠杆菌中表达的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果 １．，２．ｐＥＴ一２８ａ—ＩＧＦ经ＥｃｏＲ Ｉ和ＢａｒｎＨＩ酶 Ａ：ＳＤＳ—ＰＡＧＥ：Ｂ：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 切；３．ｐＥＴ一２８ａ经肋Ｒ Ｉ和ＢａｒｎＨ Ｉ酶切； Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１．ＢＬ２１；２．ｐＥＴ一２８转化的ＢＬ２１；３．ｐＥＴ一２８一ｈｌＧＦ—Ｉ转化的 ４．ｐＳＫ—ＩＧＦ的ＰＣＲ产物；５．ｐＥＴ一２８ａ的ＰＣＲ ＢＩ２１，未诱导；４．ｐＥＴ一２８一ｈｌＧＦ—Ｉ转化的ＢＩ２１，ＩＰＴＧ诱导；２’ ４’．对应 产物；６．ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ（Ｌ／Ｈ／ｎｄⅢ）． 于ＳＤＳ—ＰＡＧＥ中２ ４。
２．２重组病毒ＢｍＮＰＶ—ｈＩＧＦ—Ｉ的筛选及表达产物鉴定 ｐＢａｃＰＡＫ８一ｈＥＧＦ—Ｉ与经Ｂｓｕ３６ Ｉ酶切线性化的Ｂｍ—ＢａｃＰＡＫ６ ＤＮＡ共转染ＢｍＮ细胞，通过空斑筛选 获得重组病毒Ｂｍ—Ｂａｃ—ｈＩＧＦ—Ｉ，感染ＢｍＮ细胞，抽提细胞总ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增出约６００ｂｐ左右ＤＮＡ片段； 感染正常家蚕，５天后取发病蚕血，抽取总ＤＮＡ，ＰＣＲ也扩增出一条约６００ｂｐ的片段，与转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８一 ｈＩＧＦ一工用ＢａｍＨ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｉ酶切出的ＤＮＡ片段大小一致（图３）。
图３重组病毒ＤＮＡ的ＲＣＲ鉴定 １．感染重组病毒Ｂｍ—Ｂａｃ—ｈＩＧＦ—Ｉ的蚕血淋 巴；２．感染重组病毒的Ｂｒａｎ细胞；３．转移载体 ｐＢａｅＰＡＫ８一ｈｌＧＦ—Ｉ，ＢａｒｎＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶切：４． ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ。
Ｍ Ｉ ２ ３ ４ ５ ２２ ｋ１） 图４ ｈＩＧＦ—Ｉ在家蚕血淋巴中表达的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１．接种线性化病毒的家蚕血淋巴；２．一５．感染重组病毒ｌ、 ３、４、５天的家蚕血淋巴。
２．３ 重组病毒ＢｍＮＰＶ—ｈｌＧＦ—Ｉ在家蚕体内的表达 将感染重组病毒１２０ ｈ后的家蚕血淋巴进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析（图４），发现在约２２ ｋＤ处可见有一特异条 带，该分子量条带与ｈｌＧＦ—Ｉ基因ＯＲＦ编码的多肽的理论分子量一致，表明外源基因在家蚕中得到了表达，
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